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shiliyusly

新虫 (小有名气)

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专业: 食品科学基础

[求助] 烟草转基因

大家好，我现在在做烟草叶片转基因，很多人都说烟草很容易侵染成功，但是我做了大半年最后还是失败。实在不知道问题出在哪里，希望大侠能指点下，万分感激！
出现的问题是：
与对照相比，侵染后叶片在含Hyg的培养基上愈伤生长很慢，芽发的很慢；
将转基因烟草的小芽转到含Hyg生根培养基上，无法生根，叶片黄化；
尝试过25、20、10 mg/L Hyg浓度，转基因烟草都无法正常发芽生根。

载体pCAMBIA 1300

酶切位点：BamH I （GGATCC）+ Sal I （GTCGAC）

目的基因引物
FLS-5  GGATCCATGACCGTGACACCTATTTC
FLS-3  GTCGACTCAAGCACATGTTGCAGTGAT

详细步骤：
PCR扩增
割胶回收
连PMD18-T ，转DH5a 筛菌用载体通用引物
提质粒，双酶切，割胶回收，T4酶连接
转DH5a  筛菌用载体上游+基因下游引物
提质粒，送测序，有结合问题，但能搜索到目的基因片段
电击法转化GV3101农杆菌
筛菌用载体上游+基因下游引物

烟草侵染过程：
40d无菌烟草叶片剪成1cm2小方块
MS培养基（1mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA），28℃暗培养3d
过夜摇菌液至OD600=0.6，取20ml用20ml MS培养基（含蔗糖）稀释
叶片浸入菌液摇10min，滤纸吸干
MS培养基（1mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA），28℃暗培养3d
ddH2O （250mg/L  Cb）洗3次，滤纸吸干水
MS培养基（1mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA +250mg/L Cb+25mg/L Hyg），28℃暗培养7d，再光照培养

载体pCAMBIO1300.png

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