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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 烟草转基因
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] 烟草转基因

大家好，我现在在做烟草叶片转基因，很多人都说烟草很容易侵染成功，但是我做了大半年最后还是失败。实在不知道问题出在哪里，希望大侠能指点下，万分感激！
出现的问题是：
与对照相比，侵染后叶片在含Hyg的培养基上愈伤生长很慢，芽发的很慢；
将转基因烟草的小芽转到含Hyg生根培养基上，无法生根，叶片黄化；
尝试过25、20、10 mg/L Hyg浓度，转基因烟草都无法正常发芽生根 。

载体pCAMBIA 1300  

酶切位点：BamH I （GGATCC）+ Sal I （GTCGAC）

目的基因引物
FLS-5  GGATCCATGACCGTGACACCTATTTC
FLS-3  GTCGACTCAAGCACATGTTGCAGTGAT

详细步骤：
PCR扩增
割胶回收
连PMD18-T ，转DH5a   筛菌用载体通用引物
提质粒，双酶切，割胶回收，T4酶连接
转DH5a  筛菌用载体上游+基因下游引物
提质粒，送测序，有结合问题，但能搜索到目的基因片段
电击法转化GV3101农杆菌
筛菌用载体上游+基因下游引物

烟草侵染过程：
40d无菌烟草叶片剪成1cm2小方块
MS培养基（1mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA），28℃暗培养3d
过夜摇菌液至OD600=0.6，取20ml用20ml MS培养基（含蔗糖）稀释
叶片浸入菌液摇10min，滤纸吸干
MS培养基（1mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA），28℃暗培养3d
ddH2O （250mg/L  Cb）洗3次，滤纸吸干水
MS培养基（1mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA +250mg/L Cb+25mg/L Hyg），28℃暗培养7d，再光照培养

烟草转基因
载体pCAMBIO1300.png
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1楼 2016-02-22 14:16:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

nunal

金虫 (初入文坛)
好像没什么问题，和我的步骤有点差异，1，没有28度暗培7天。2，我们用的是培养室，24度的条件。不知道你的生根培养基是什么？我用的1／2MS＋carbenicillin，其他没加。还有，你确定不是基因表达导致的。。。？最后，祝顺利～

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2楼2016-02-23 09:54:41
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genebreed

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
shiliyusly: 金币+6 2016-03-05 13:19:12
烟草转化说起来容易，真正做好要成熟体系和经验。
问题可能出在：
1.烟草植株不健康；
2.外植体切取不好；
3.侵染不成功
4.生根培养基激素比例不佳
等等。细节重要，没法简单说。
我们做了几百个烟草转化了，如有需要可以上genebreed.com联系我们。
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植物基因工程专家genebreed.com-分子克隆与转基因
5楼2016-03-03 17:57:22
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普通回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by nunal at 2016-02-23 09:54:41
好像没什么问题，和我的步骤有点差异，1，没有28度暗培7天。2，我们用的是培养室，24度的条件。不知道你的生根培养基是什么？我用的1／2MS＋carbenicillin，其他没加。还有，你确定不是基因表达导致的。。。？最后， ...

感谢你的回答！
你说的基因表达导致是什么意思呢？
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3楼2016-02-23 16:29:01
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nunal

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shiliyusly at 2016-02-23 16:29:01
感谢你的回答！
你说的基因表达导致是什么意思呢？...

转入的基因可能导致植物生长发育不正常。。。不了解你转的基因，纯属猜测

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4楼2016-02-24 21:05:26
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by genebreed at 2016-03-03 17:57:22
烟草转化说起来容易，真正做好要成熟体系和经验。
问题可能出在：
1.烟草植株不健康；
2.外植体切取不好；
3.侵染不成功
4.生根培养基激素比例不佳
等等。细节重要，没法简单说。
我们做了几百个烟草转化了， ...

谢谢！红花烟草开花的时候大概多高呢？要到1米才会开花吗？很想看到它的花色
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6楼2016-03-05 13:19:02
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你太善良

新虫 (著名写手)
黄酮醇合酶，分流，导致花青素降低，花色变白。

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7楼2016-03-06 21:08:42
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by nunal at 2016-02-24 21:05:26
转入的基因可能导致植物生长发育不正常。。。不了解你转的基因，纯属猜测
...

你好，你做的烟草是什么品种呢？我真的好想知道他多久开花啊
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8楼2016-03-23 12:06:52
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上官影然

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

亲，你有没有出现过摇菌出现沉淀，和侵染共培养不长菌落的情况，还有就是用一摇后的菌液再图板不长单菌落，长出来的是一平板的浑浊液体。已经排除画板问题
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9楼2016-06-05 21:29:31
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你太善良

新虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 上官影然 at 2016-06-05 21:29:31
亲，你有没有出现过摇菌出现沉淀，和侵染共培养不长菌落的情况，还有就是用一摇后的菌液再图板不长单菌落，长出来的是一平板的浑浊液体。已经排除画板问题

这个很正常，培养温度千万不要超过28度，一过质粒丢失，GG思密达，因为很多培养箱是没有制冷的，夏天就难受了。

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10楼2016-06-09 20:57:50
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