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shiliyusly新虫 (小有名气)
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[求助]
烟草转基因
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大家好，我现在在做烟草叶片转基因，很多人都说烟草很容易侵染成功，但是我做了大半年最后还是失败。实在不知道问题出在哪里，希望大侠能指点下，万分感激！ 出现的问题是： 与对照相比，侵染后叶片在含Hyg的培养基上愈伤生长很慢，芽发的很慢； 将转基因烟草的小芽转到含Hyg生根培养基上，无法生根，叶片黄化； 尝试过25、20、10 mg/L Hyg浓度，转基因烟草都无法正常发芽生根 。 载体pCAMBIA 1300 酶切位点：BamH I （GGATCC）+ Sal I （GTCGAC） 目的基因引物 FLS-5 GGATCCATGACCGTGACACCTATTTC FLS-3 GTCGACTCAAGCACATGTTGCAGTGAT 详细步骤： PCR扩增 割胶回收 连PMD18-T ，转DH5a 筛菌用载体通用引物 提质粒，双酶切，割胶回收，T4酶连接 转DH5a 筛菌用载体上游+基因下游引物 提质粒，送测序，有结合问题，但能搜索到目的基因片段 电击法转化GV3101农杆菌 筛菌用载体上游+基因下游引物 烟草侵染过程： 40d无菌烟草叶片剪成1cm2小方块 MS培养基（1mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA），28℃暗培养3d 过夜摇菌液至OD600=0.6，取20ml用20ml MS培养基（含蔗糖）稀释 叶片浸入菌液摇10min，滤纸吸干 MS培养基（1mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA），28℃暗培养3d ddH2O （250mg/L Cb）洗3次，滤纸吸干水 MS培养基（1mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA +250mg/L Cb+25mg/L Hyg），28℃暗培养7d，再光照培养  载体pCAMBIO1300.png |
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4楼2016-02-24 21:05:26
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好像没什么问题，和我的步骤有点差异，1，没有28度暗培7天。2，我们用的是培养室，24度的条件。不知道你的生根培养基是什么？我用的1／2MS＋carbenicillin，其他没加。还有，你确定不是基因表达导致的。。。？最后，祝顺利～ 发自小木虫Android客户端 |
2楼2016-02-23 09:54:41
shiliyusly
新虫 (小有名气)
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3楼2016-02-23 16:29:01
genebreed
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5楼2016-03-03 17:57:22
