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王希lily新虫 (初入文坛)
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[求助]
谁做过IMPACT-TWIN 蛋白纯化呀？紧急求助 已有2人参与
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| 本人做原核表达已有一年多了，用的表达载体是PTWIN1，好不容易表达了且表达在上清，但是在纯化上又卡住了。纯化是买的NEB公司的几丁质珠，按照说明书进行的操作：将5ml chitin beads倒入2.5×10 cm柱中，10个柱床体积的缓冲液Buffer B1（20mM Tris-Hcl 8.5,500mM Nacl,1mM EDTA）进行柱平衡；将澄清的细胞粗提物缓慢加入Chitin柱，流速约为0.5-1.0 ml/min；用100 mL的缓冲液Buffer B1彻底洗柱；用3倍柱床体积Buffer B2（20mM Tris-Hcl 6.5,500mM Nacl,1mM EDTA）洗柱，4℃放置48h；48h后用3倍柱床体积的Buffer B1，将目的蛋白洗脱收集，但是收集时仪器上没有峰值。上样后的穿出液在SDS-PAGE上证明已经挂上了柱子，但是最后的洗脱液在SDS-PAGE上什么也没有。请问哪位大侠做此类纯化或者用过几丁质株呢？给点意见或者建议吧，本人已做了2个月了，一直纯化不出来，紧急求助各位大神。 |
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