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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » In-fusion 克隆，做了很久没有出结果，求助
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你的蛔虫

新虫 (初入文坛)

[交流] In-fusion 克隆，做了很久没有出结果，求助 已有10人参与

最近一直在做in-fusion 克隆连接，片段插入载体（14300bp），目的片段1023bp。
买的In-Fusion Cloning Kit货号是639649，只包含一支50个反应的5×premix，一支pUC19线性化载体和一个2kb的片段。我按照说明书的方法配好反应混合液之后（载体150-200ng，目的片段80ng，载体和目的片段各1 uL,5×premix 1uL,总体系51uL），50℃反应15min，然后转化DH5α感受态细胞。转化至感受态细胞的的反应液的量2uL、3uL、5uL均用过。但是第二天发现只有阳性的pUC19正常长起了阳性单菌落，我的克隆样品一个菌都不长。引物同源序列片段检查了很多次，没有问题。载体和目的片段都是凝胶回收的纯化的。现在不知道问题出在哪里了，请有经验的虫友们出出招，多谢了！
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1楼 2016-02-19 13:16:03
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你的蛔虫

新虫 (初入文坛)
谢谢各位虫友们提供的建议，我试过了延长重组时间至30min，依然是一个菌也没长。关于换试剂盒，因为现在在日本做试验，大家说的那些试剂盒在这里买不到。只能用这个试剂盒。甚至，我还用T4酶也连接过，况且是单酶切，也没有去磷酸化，直接连的，目的片段和载体同样也是胶回收纯化，但也是一个菌都没长。希望大家在给出出招，先在此谢过了
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13楼2016-02-24 09:15:37
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erryzhen

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
2楼2016-02-19 13:53:02
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你的蛔虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by erryzhen at 2016-02-19 13:53:02
你的载体与目的片段的重复序列是多少呢？

15bp
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3楼2016-02-19 14:30:54
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adamhe

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
使用如意连kit,保证做得出来。in-Fusion有时接头搞不好会连接不成功，不怎么稳定
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4楼2016-02-19 16:31:09
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