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木虫 (小有名气)

[求助] 用感受态大肠杆菌做质粒扩增,涂平板挑单个菌落37度摇菌,请问... 已有1人参与

用感受态大肠杆菌做质粒扩增,涂平板挑单个菌落37度摇菌,请问摇菌时间20小时行不行,是不是太久了?还有,一般我们做质粒扩增,如果扩增前的质粒序列是我们想要的并且没问题,那么扩增后的质粒我们还需要测序验证吗? @biostar2009

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duanjifu520

铜虫 (正式写手)

20个小时是没有问题的,我经常保持12-24小时之间,我用的是pet的质粒,另外,你这个是扩增质粒,如果确定母带质粒没有问题的话,正确扩增的概率在99%,如果实在不放心,扩增后跑胶时,可以酶切下再跑胶,测序方便的话当然测序更好,但是个人觉得没必要,除非后边的实验出现问题了,可以反过来验证

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2楼2016-01-26 13:22:00
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观享世界

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by duanjifu520 at 2016-01-26 13:22:00
20个小时是没有问题的,我经常保持12-24小时之间,我用的是pet的质粒,另外,你这个是扩增质粒,如果确定母带质粒没有问题的话,正确扩增的概率在99%,如果实在不放心,扩增后跑胶时,可以酶切下再跑胶,测序方便的 ...

有时候我会把长好单菌落的平板放到4度冰箱,方便下一次挑菌摇菌,这样可以吗?

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书写人生
3楼2016-01-26 14:49:19
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by 观享世界 at 2016-01-26 14:49:19
有时候我会把长好单菌落的平板放到4度冰箱,方便下一次挑菌摇菌,这样可以吗?
...

完全没问题的,我一般就将单克隆放在200μl培养基中,摇三个小时,稍微有点浓就可以了,然后菌落PCR验证。验证正确的再扩大体积培养,这样节省时间。

质粒扩增的话,我觉得都没有必要涂板挑单克隆……直接接一级种培养就好。反正有抗生素嘛……
4楼2016-01-26 15:36:04
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