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cynjau金虫 (小有名气)
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[交流]
转化10多次得不到转化子，请大家帮忙分析
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最经一个多月一直在做这个实验，10次多没有获得重组子，很是郁闷.请大家帮忙分析一下： （1）目的片段先克隆到pMD19 sample上提取质粒，用TAKARA购买的BamHI和speI双酶切12小时，回收我的目的片段300bp; (2)重组用的质粒约5900bp,同样用TAKARA购买的BamHI和speI双酶切12小时，回收酶切产物； （3）回收的目的片段和载体电泳后估计其浓度后，按照载体：目的片段=1：10来T4连接酶16度，连接16小时后转化； 我觉得转化和感受态没有问题啊，10多次了，感受态也用T载体检测了没有问题的！可是就是不知道为什么就是得不到重组子啊？ 现在怀疑是不是没有连接上。可是载体5900bp,目的片段300bp.连接产物电泳和质粒在胶上也看不出来啊！有什么办法确定是否连接上呢？ 还有就是在转化后吸取100ul涂在抗性平板上，有时出现满板的糊状，一片一片的，仔细看是些很微小微小的菌落，可是他们长48小时还是那么小，这有是怎么回事？ 请大家帮忙分析啊，谢谢啊，极度郁闷中！ |
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4楼2008-10-05 21:13:25
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建议 1、直接从质粒上pcr你的目的片段，不要从质粒上酶切，pcr完直接回收，不要切胶回收，回收之前跑1微升看看，有没有杂带，杂带太多就不能直接回收了。 2、质粒酶切完，也直接回收，不要切胶回收，不过这样肯定会有空质粒，有假阳性，需要耐心挑选。 3、载体：目的片段=1：4 4、连接之前，加入载体目的基因后65度水浴热激2分钟，后加入连接酶，连接16小时以上，转化。 5、连接产物验证可以用pcr方式检验，设计引物，该引物包含一段载体片段且包含一段你得目的基因片段，PCR，看是否有相应大小条带，可以测序，看是否连接上。 因为切胶回收会影响连接，能不切尽量不要切，热激有助于连接，不会影响DNA，再多转几次，注意不要染菌。有了转化子，尽量全部验证。 祝早日成功~ |
5楼2008-10-05 22:42:14