| 查看: 671 | 回复: 5 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
cynjau金虫 (小有名气)
|
[交流]
转化10多次得不到转化子，请大家帮忙分析
|
||
|
最经一个多月一直在做这个实验，10次多没有获得重组子，很是郁闷.请大家帮忙分析一下： （1）目的片段先克隆到pMD19 sample上提取质粒，用TAKARA购买的BamHI和speI双酶切12小时，回收我的目的片段300bp; (2)重组用的质粒约5900bp,同样用TAKARA购买的BamHI和speI双酶切12小时，回收酶切产物； （3）回收的目的片段和载体电泳后估计其浓度后，按照载体：目的片段=1：10来T4连接酶16度，连接16小时后转化； 我觉得转化和感受态没有问题啊，10多次了，感受态也用T载体检测了没有问题的！可是就是不知道为什么就是得不到重组子啊？ 现在怀疑是不是没有连接上。可是载体5900bp,目的片段300bp.连接产物电泳和质粒在胶上也看不出来啊！有什么办法确定是否连接上呢？ 还有就是在转化后吸取100ul涂在抗性平板上，有时出现满板的糊状，一片一片的，仔细看是些很微小微小的菌落，可是他们长48小时还是那么小，这有是怎么回事？ 请大家帮忙分析啊，谢谢啊，极度郁闷中！ |
回复此楼» 猜你喜欢
今天基金会出结果吗？20260819
已经有16人回复
-
科研孤儿太难了
已经有16人回复
-
filecode=后面第一个是大写字母
已经有13人回复
-
我面上完蛋了
已经有6人回复
-
应该是下周三26日公布了吧？
已经有4人回复
-
投稿咨询
已经有7人回复
-
今天放榜没戏了吧
已经有11人回复
-
让我中一个面上吧！
已经有12人回复
-
基金啊基金
已经有4人回复
-
放榜前的不淡定
已经有13人回复
cynjau
金虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1945.1
- 散金: 5
- 红花: 1
- 帖子: 90
- 在线: 137.2小时
- 虫号: 539780
- 注册: 2008-04-05
- 性别: GG
- 专业: 微生物资源与分类学
3楼2008-10-05 09:04:24
2楼2008-10-05 08:51:30
wordsworth3180
木虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 3624.4
- 帖子: 703
- 在线: 337.8小时
- 虫号: 568607
- 注册: 2008-06-03
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
4楼2008-10-05 21:13:25
silviasj
金虫 (著名写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 贵宾: 0.21
- 金币: 1204.3
- 帖子: 1385
- 在线: 1.5小时
- 虫号: 449388
- 注册: 2007-11-02
- 性别: MM
- 专业: 微生物与生化药学
|
建议 1、直接从质粒上pcr你的目的片段，不要从质粒上酶切，pcr完直接回收，不要切胶回收，回收之前跑1微升看看，有没有杂带，杂带太多就不能直接回收了。 2、质粒酶切完，也直接回收，不要切胶回收，不过这样肯定会有空质粒，有假阳性，需要耐心挑选。 3、载体：目的片段=1：4 4、连接之前，加入载体目的基因后65度水浴热激2分钟，后加入连接酶，连接16小时以上，转化。 5、连接产物验证可以用pcr方式检验，设计引物，该引物包含一段载体片段且包含一段你得目的基因片段，PCR，看是否有相应大小条带，可以测序，看是否连接上。 因为切胶回收会影响连接，能不切尽量不要切，热激有助于连接，不会影响DNA，再多转几次，注意不要染菌。有了转化子，尽量全部验证。 祝早日成功~ |
5楼2008-10-05 22:42:14
40