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mlbiosci

新虫 (正式写手)

目测包涵体表达,为促进可溶表达,可更换载体,表达菌,降低诱导剂浓度,适当降低诱导温度。

发自小木虫Android客户端
11楼2016-01-23 07:52:52
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)

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2楼: Originally posted by a86052 at 2016-01-18 10:04:38
这有什么奇怪,超声破碎后菌夜什么情况,是比较清的那种还是发白?如果发白可能是包涵体或者蛋白变性了

菌液是发白的那种
好好生活,好好工作
12楼2016-01-27 16:17:34
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)

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5楼: Originally posted by XMC-7 at 2016-01-18 10:55:44
大专家的意思是8M的尿素,也做脲。避免误会,在此澄清。...

谢谢大神!
好好生活,好好工作
13楼2016-01-27 16:19:59
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)

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3楼: Originally posted by XMC-7 at 2016-01-18 10:17:14
莫慌莫慌,看你表述的情况,并不奇怪啊。破菌后,目的蛋白不溶于破菌Buffer,下面离心后增溶纯化就是了。额,是没人带的可怜新手么?

我用的是Binding  Buffer,你说的这种情况也是有可能的,谢谢!只能过年后再做了,预祝春节愉快!
好好生活,好好工作
14楼2016-01-27 16:21:43
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)

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7楼: Originally posted by linglingchen at 2016-01-18 11:11:53
会不会是因为超生的时间长了,水发热,然后蛋白质变性了?

超声破碎的时候样品周围我放了冰的,也就是低温,应该不存在水发热呀
好好生活,好好工作
15楼2016-01-27 16:23:55
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)

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10楼: Originally posted by 深山老泉 at 2016-01-23 02:20:43
包涵体,试一试改变诱导条件,尽量得到可溶性蛋白,后面纯化就简单了。

谢谢
好好生活,好好工作
16楼2016-01-27 16:25:09
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)

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8楼: Originally posted by 鱼大喵 at 2016-01-18 21:09:16
1.我感觉你超声5s停止的时间有点短,超声热量很大的
2.离心后看沉淀是不是发白,是的话就可能是包涵体了
3.将你的蛋白序列做一下跨膜预测,看是不是有疏水域

都说5S时间太长了啊。离心后的沉淀是黑色的。跨膜预测我会做一下的,谢谢
好好生活,好好工作
17楼2016-01-27 16:26:37
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)

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3楼: Originally posted by XMC-7 at 2016-01-18 10:17:14
莫慌莫慌,看你表述的情况,并不奇怪啊。破菌后,目的蛋白不溶于破菌Buffer,下面离心后增溶纯化就是了。额,是没人带的可怜新手么?

不算新手吧,实验室老师带了一次就要我自己做,当时也没做出来
好好生活,好好工作
18楼2016-01-27 16:29:57
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)

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4楼: Originally posted by hc-material at 2016-01-18 10:31:39
超声破碎,上清里面没有目的蛋白,全沉淀里面,估计是包涵体了。那就将沉淀用8M的尿溶解,然后在离心,溶解后的上清在跑电泳,在纯化。纯化完了,在复性。或者可尝试低温诱导,避免包涵体的形成,可以25度诱导试试, ...

好的,谢谢大神
好好生活,好好工作
19楼2016-01-27 16:31:02
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MarchZR

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

遇到包涵体的情况最先考虑的不是你破碎的哪些条件等,那都是次要的,不足以导致包涵体的形成。你现在有两条路可以选择:要不就继续纯化包涵体,最后复性得到蛋白。要不就重新的设计基因合成新的质粒,再次表达然后纯化。你要知道包涵体不是你随随便便改变一下诱导条件温度,换换试剂纯化就能避免的,你要从基因的源头开始考虑。根据密码子的简并性,原核系统不喜欢这个密码子它就不会老老实实的表达,就会形成包涵体,要不就表达量低等情况,所以你要密码子优化,mRNA结构优化等。。。这就要说的多了。(关于优化可以看一下这篇资料:http://www.detaibio.com/gene-expression-optimization.html

现在的问题是:蛋白是表达了,但是你纯化不出来蛋白?其实这是一个不算完全正确的说法,因为你只是在上清中没有得到蛋白,但是你没有纯化包涵体啊(包涵体就是你说的沉淀)。也许你还不太了解原核表达这个系统,重组蛋白的表达系统有原核 表达系统,哺乳动物表达系统,酵母、昆虫表达系统,在这之中,原核系统被运用的最为广泛,原因是因为原核表达操作简便,花费少,但是缺点就是表达的蛋白活性无保证,且无法实现糖基化等修饰,最重要的一点是容易形成包涵体,一般的个人实验遇到包涵体是很头疼的,因为没活性又不好纯化,又不好复性,但是包涵体纯度又高,所以既然选择原核表达,这是不变的,那就想方设法的提高原核表达蛋白可溶性,降低包涵体的产生,方法有很多,例如密码子优化(最为重要),降低诱导温度,优化mRNA结构等等,具体优化方法可见 http://www.detaibio.com/topics/how-to-express-soluble-protein.html

我劝楼主先决定好选择那条路走,这是第一步,包涵体纯化时间短楼主现在可以就开始纯化试试,也要考虑到是否能复性成功,如果对蛋白活性有要求,建议就不要选择继续纯化了吧。。
然后一步一步,慢慢的争取每一步都是对的!基因也不能随随便便设计,最好找一个有经验的人帮忙,慢可以但是一定一步一个准!不然到了纯化那一步又烦恼了
20楼2016-01-28 11:39:30
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