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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 蛋白质纯化问题
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
目测包涵体表达，为促进可溶表达，可更换载体，表达菌，降低诱导剂浓度，适当降低诱导温度。

发自小木虫Android客户端
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11楼2016-01-23 07:52:52
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by a86052 at 2016-01-18 10:04:38
这有什么奇怪，超声破碎后菌夜什么情况，是比较清的那种还是发白？如果发白可能是包涵体或者蛋白变性了

菌液是发白的那种
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好好生活，好好工作
12楼2016-01-27 16:17:34
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by XMC-7 at 2016-01-18 10:55:44
大专家的意思是8M的尿素，也做脲。避免误会，在此澄清。...

谢谢大神！
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好好生活，好好工作
13楼2016-01-27 16:19:59
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by XMC-7 at 2016-01-18 10:17:14
莫慌莫慌，看你表述的情况，并不奇怪啊。破菌后，目的蛋白不溶于破菌Buffer，下面离心后增溶纯化就是了。额，是没人带的可怜新手么？

我用的是Binding  Buffer，你说的这种情况也是有可能的，谢谢！只能过年后再做了，预祝春节愉快！
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好好生活，好好工作
14楼2016-01-27 16:21:43
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by linglingchen at 2016-01-18 11:11:53
会不会是因为超生的时间长了，水发热，然后蛋白质变性了？

超声破碎的时候样品周围我放了冰的，也就是低温，应该不存在水发热呀
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好好生活，好好工作
15楼2016-01-27 16:23:55
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湖南戴鹏辉

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10楼: Originally posted by 深山老泉 at 2016-01-23 02:20:43
包涵体，试一试改变诱导条件，尽量得到可溶性蛋白，后面纯化就简单了。

谢谢
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好好生活，好好工作
16楼2016-01-27 16:25:09
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by 鱼大喵 at 2016-01-18 21:09:16
1.我感觉你超声5s停止的时间有点短，超声热量很大的
2.离心后看沉淀是不是发白，是的话就可能是包涵体了
3.将你的蛋白序列做一下跨膜预测，看是不是有疏水域

都说5S时间太长了啊。离心后的沉淀是黑色的。跨膜预测我会做一下的，谢谢
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好好生活，好好工作
17楼2016-01-27 16:26:37
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湖南戴鹏辉

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3楼: Originally posted by XMC-7 at 2016-01-18 10:17:14
莫慌莫慌，看你表述的情况，并不奇怪啊。破菌后，目的蛋白不溶于破菌Buffer，下面离心后增溶纯化就是了。额，是没人带的可怜新手么？

不算新手吧，实验室老师带了一次就要我自己做，当时也没做出来
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好好生活，好好工作
18楼2016-01-27 16:29:57
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by hc-material at 2016-01-18 10:31:39
超声破碎，上清里面没有目的蛋白，全沉淀里面，估计是包涵体了。那就将沉淀用8M的尿溶解，然后在离心，溶解后的上清在跑电泳，在纯化。纯化完了，在复性。或者可尝试低温诱导，避免包涵体的形成，可以25度诱导试试， ...

好的，谢谢大神
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好好生活，好好工作
19楼2016-01-27 16:31:02
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MarchZR

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

遇到包涵体的情况最先考虑的不是你破碎的哪些条件等，那都是次要的，不足以导致包涵体的形成。你现在有两条路可以选择：要不就继续纯化包涵体，最后复性得到蛋白。要不就重新的设计基因合成新的质粒，再次表达然后纯化。你要知道包涵体不是你随随便便改变一下诱导条件温度，换换试剂纯化就能避免的，你要从基因的源头开始考虑。根据密码子的简并性，原核系统不喜欢这个密码子它就不会老老实实的表达，就会形成包涵体，要不就表达量低等情况，所以你要密码子优化，mRNA结构优化等。。。这就要说的多了。（关于优化可以看一下这篇资料：http://www.detaibio.com/gene-expression-optimization.html）

现在的问题是：蛋白是表达了，但是你纯化不出来蛋白？其实这是一个不算完全正确的说法，因为你只是在上清中没有得到蛋白，但是你没有纯化包涵体啊（包涵体就是你说的沉淀）。也许你还不太了解原核表达这个系统，重组蛋白的表达系统有原核 表达系统，哺乳动物表达系统，酵母、昆虫表达系统，在这之中，原核系统被运用的最为广泛，原因是因为原核表达操作简便，花费少，但是缺点就是表达的蛋白活性无保证，且无法实现糖基化等修饰，最重要的一点是容易形成包涵体，一般的个人实验遇到包涵体是很头疼的，因为没活性又不好纯化，又不好复性，但是包涵体纯度又高，所以既然选择原核表达，这是不变的，那就想方设法的提高原核表达蛋白可溶性，降低包涵体的产生，方法有很多，例如密码子优化（最为重要），降低诱导温度，优化mRNA结构等等，具体优化方法可见 http://www.detaibio.com/topics/how-to-express-soluble-protein.html

我劝楼主先决定好选择那条路走，这是第一步，包涵体纯化时间短楼主现在可以就开始纯化试试，也要考虑到是否能复性成功，如果对蛋白活性有要求，建议就不要选择继续纯化了吧。。
然后一步一步，慢慢的争取每一步都是对的！基因也不能随随便便设计，最好找一个有经验的人帮忙，慢可以但是一定一步一个准！不然到了纯化那一步又烦恼了
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20楼2016-01-28 11:39:30
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