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蛋白质纯化问题 已有9人参与
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各位大神，我做了蛋白质的原核表达实验，能清晰的看到目的蛋白质表达了（载体是PET-28a,宿主是BL21（DE3）），但是我后面做蛋白质纯化实验的时候不能纯化到蛋白。我的超声波破碎细胞的条件是：400W，5S破碎，5S停止，30分钟，后面分别SDS-PAGE检测上清液和沉淀，发现上清液没有纯化到我的蛋白，蛋白都在沉淀里面了，条带特别明显，不知道怎么回事？是不是细胞没有破碎完全呢？怎么样才能解决这个问题？求大神指点，相互交流。谢谢！ IMG_20160108_170606.jpg |
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【答案】应助回帖
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遇到包涵体的情况最先考虑的不是你破碎的哪些条件等，那都是次要的，不足以导致包涵体的形成。你现在有两条路可以选择：要不就继续纯化包涵体，最后复性得到蛋白。要不就重新的设计基因合成新的质粒，再次表达然后纯化。你要知道包涵体不是你随随便便改变一下诱导条件温度，换换试剂纯化就能避免的，你要从基因的源头开始考虑。根据密码子的简并性，原核系统不喜欢这个密码子它就不会老老实实的表达，就会形成包涵体，要不就表达量低等情况，所以你要密码子优化，mRNA结构优化等。。。这就要说的多了。（关于优化可以看一下这篇资料：http://www.detaibio.com/gene-expression-optimization.html） 现在的问题是：蛋白是表达了，但是你纯化不出来蛋白？其实这是一个不算完全正确的说法，因为你只是在上清中没有得到蛋白，但是你没有纯化包涵体啊（包涵体就是你说的沉淀）。也许你还不太了解原核表达这个系统，重组蛋白的表达系统有原核 表达系统，哺乳动物表达系统，酵母、昆虫表达系统，在这之中，原核系统被运用的最为广泛，原因是因为原核表达操作简便，花费少，但是缺点就是表达的蛋白活性无保证，且无法实现糖基化等修饰，最重要的一点是容易形成包涵体，一般的个人实验遇到包涵体是很头疼的，因为没活性又不好纯化，又不好复性，但是包涵体纯度又高，所以既然选择原核表达，这是不变的，那就想方设法的提高原核表达蛋白可溶性，降低包涵体的产生，方法有很多，例如密码子优化（最为重要），降低诱导温度，优化mRNA结构等等，具体优化方法可见 http://www.detaibio.com/topics/how-to-express-soluble-protein.html 我劝楼主先决定好选择那条路走，这是第一步，包涵体纯化时间短楼主现在可以就开始纯化试试，也要考虑到是否能复性成功，如果对蛋白活性有要求，建议就不要选择继续纯化了吧。。 然后一步一步，慢慢的争取每一步都是对的！基因也不能随随便便设计，最好找一个有经验的人帮忙，慢可以但是一定一步一个准！不然到了纯化那一步又烦恼了 |
20楼2016-01-28 11:39:30
a86052
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hc-material
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4楼2016-01-18 10:31:39
