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siyuansing

银虫 (小有名气)

[求助] 酶切问题已有2人参与

T载体插入了500bp的片段,T载体是takara的pMD19(simple)2692bp,无酶切位点,目的基因两段构建有EcoR I和Xba I两个酶切位点。单酶切没有效果,双酶切表现出了单酶切的效果。如图,从左向右分别是:1000marker,质粒跑胶结果,双酶切效果,EcoR I单酶切,Xba I单酶切;最右是5000的maker。
双酶切体系试过两个,效果都如同图中一样:
EcoR I:1μl                                  EcoR I:1μl
Xba I:1μl                                    Xba I:1μl
x10 M buffer:2μl                        x10 M buffer:2μl
BSA:2μl                                     DNA(300ng/μl):3μl
DNA(300ng/μl):3μl               DEPC水:16μl
DEPC水:13μl

酶都是takara的限制性内切酶,酶切条件都是37℃,12h。
EcoR I的酶切体系为:
EcoR I:1μl
x10 H buffer:2μl
DEPC水:17μl

Xba I的酶切体系为:
Xba I:1μl
x10 M buffer:2μl
BSA:2μl
DEPC水:15μl

单酶切体系都是根据说明书上配的,双酶切体系是根据说明书中双酶切反应使用表配的。
搞不懂为什么单酶切没有效果,双酶切却只表现出了单酶切的效果。另外,质粒总大小应该是3100bp左右,没有切开的质粒会跑出两条带么?而且跑胶结果的大小远大于3100bp。
请大家帮忙解惑,谢谢大家了。

酶切问题
PC 2016-01-16 14 时 21 分副本.jpg
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yjchsh

铁杆木虫 (正式写手)

Dr.

质粒跑胶应该是3条带,有3种不同的状态,全闭环,半开环和开环。提取质量决定了他们的比例,看不到不代表不存在

发自小木虫Android客户端
12楼2018-03-08 08:28:53
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smallkokoko

新虫 (初入文坛)

虽然我也不懂为什么,但是加油哦!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2016-01-16 15:22:50
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smallkokoko

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
提质粒有两条带是正常的。因为还有些基因组啊或者断掉的DNA

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2016-01-16 15:25:22
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sonny

金虫 (著名写手)


siyuansing: 回帖置顶 2016-01-17 12:49:44
XbaI受dam甲基化影响严重,我记得识别序列为TCTAGA,如果酶切位点前面为GA或者后面为TC,就肯定切不开!ECORI我不太记得了,好好看看!都是常用酶,一般是因为疏忽了这种问题导致的!

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

4楼2016-01-16 15:38:37
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