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克隆活化小提质粒相关问题 已有1人参与
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一年多以前，克隆时挑一个白菌落到氨苄浓度为100μg/mL的LB培养基里摇菌，菌液测序后加甘油15%保存在-80℃，中途-80℃冰箱出故障，质粒有在低于-80℃保存过1天后转移到-20℃，现在想要活化质粒，有几个问题想要请教大家： （1）质粒保存低于-80℃（具体多少不知道）有影响吗？ （2）活化时我看有人说需要划线挑菌摇菌，我想请问可以直接加甘油菌液到LB培养基里摇菌吗？LB里需要加氨苄吗？氨苄浓度还是多少呢？时间太久，质粒上的氨苄抗性会不会丢失，加了氨苄会不会长不出？ （3）活化摇菌的转速时间多少呢?我有看到说最好控制在对数期内，13~16h，因为我们只有低转速的摇床，130rpm的话摇过夜（18h以上）可以吗？ 综上，就是想问一下质粒活化的操作方法，希望能详细解答一下~刚开始做这部分，还请大家多多指教~ |
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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①无影响，而且建议低温保存，但是要避免反复冻融。 ②可以直接加甘油菌液到LB培养基，但前提是甘油管菌种要品质良好。若容易染菌，则需挑单克隆。活化时要加抗生素的，100μg/mL浓度就可以，我也是用的这个浓度。时间很久的话也要加抗生素，可能某些菌体丢失质粒而失去抗性长不出（不是质粒上抗性丢失，而是丢失质粒），但这不就是加氨苄抗生素的目的吗？将含有质粒的菌培养出来。 ③低转速的摇床就可以的，这个影响的是培养基的含氧量，不过不是特别重要。 总之，我活化质粒就是将之前-80保存的甘油菌在抗性培养基中按1%量加入，培养过夜，第二天抽质粒。 另外，我还会在-80度单独保存一管质粒，以防这个甘油菌出现什么问题~这样我可以再做一次转化就好了~ |
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