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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 有关大肠杆菌western bloting.做了两次了，还是膜上什么也没有
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梦的金色城堡

新虫 (小有名气)

[求助] 有关大肠杆菌western bloting.做了两次了，还是膜上什么也没有 已有2人参与

做了蛋白iptg表达，用考马斯亮蓝染色，可是结果并不明显，我的目的蛋白是26.然后是做wb确定一下，用的半干转，DAB显色，但是我做了两次了还是没有任何条带，之前学妹做的其他蛋白，有条带出来，所以我用的东西应该没有问题。marker有条带，但是好像没有什么背景，也没有用内参，不知道是什么原因？是根本没有诱导出来，还是步骤错了，还是蛋白转过了还是没转上…？有没有懂的帮忙分析一下吧，谢谢，不胜感激～～失落中

有关大肠杆菌western bloting.做了两次了，还是膜上什么也没有


有关大肠杆菌western bloting.做了两次了，还是膜上什么也没有-1


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生物-医药
1楼 2016-01-04 22:27:18
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

黄腾

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梦的金色城堡: 金币+2, ★有帮助 2016-01-25 15:38:08
首先，marker出了条带，那就一定是转上了，26的分子量还是比较小，电泳时间可以再短一点，我是做也是做半干转的，确定一个内参再做还是比较好，你也可以确定一下抗体有没有问题，加一个确定已表达的样品做对照，或者是点一个合成蛋白样品，就是你们做抗体用的蛋白。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

梦的金色城堡
3楼2016-01-05 19:00:21
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普通回帖

梦的金色城堡

新虫 (小有名气)
我的蛋白最靠近marker的那个是空白对照…

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生物-医药
2楼2016-01-04 22:37:38
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梦的金色城堡

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 黄腾 at 2016-01-05 19:00:21
首先，marker出了条带，那就一定是转上了，26的分子量还是比较小，电泳时间可以再短一点，我是做也是做半干转的，确定一个内参再做还是比较好，你也可以确定一下抗体有没有问题，加一个确定已表达的样品做对照，或者 ...

好的，谢谢你，我明天再做一次。我学妹的蛋白表达比较高，她也用的一抗1:1000，转45分钟，有条带。我的会不会是表达低所以没有呢？今天又配了一抗1:500打算试试，电转时间应该多少合适呢，蛋白26转了45分钟，marker正反面都有，会不会是转跑啦？

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生物-医药
4楼2016-01-05 20:28:25
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黄腾

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 梦的金色城堡 at 2016-01-05 20:28:25
好的，谢谢你，我明天再做一次。我学妹的蛋白表达比较高，她也用的一抗1:1000，转45分钟，有条带。我的会不会是表达低所以没有呢？今天又配了一抗1:500打算试试，电转时间应该多少合适呢，蛋白26转了45分钟，marke ...

你可以在一个泳道点一你学妹的样品，如果她的有条带而你的没有那就是没表达或没表达，marker不知道你用的是什么膜，一般是不会转到反面的
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5楼2016-01-05 21:37:32
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wuchh123

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
6楼2016-01-06 09:49:26
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haze12344

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by wuchh123 at 2016-01-06 09:49:26
大肠杆菌的蛋白我怎么总是提取不出来啊？做SDS_PAGE总是没有条带

很好提啊，收菌后直接加2x loading溶解，再煮沸就可以上样了
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生物你好
7楼2016-01-08 07:57:08
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wuchh123

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
8楼2016-01-08 11:58:25
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梦的金色城堡

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 黄腾 at 2016-01-05 21:37:32
你可以在一个泳道点一你学妹的样品，如果她的有条带而你的没有那就是没表达或没表达，marker不知道你用的是什么膜，一般是不会转到反面的...

点了学妹的，有条带了，今天才知道我是用错了菌…我们导师在美国，我用的是克隆载体，做了两个月了才发现…呜呜我要哭了。谢谢你了

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生物-医药
9楼2016-01-08 15:39:25
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梦的金色城堡

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wuchh123 at 2016-01-06 09:49:26
大肠杆菌的蛋白我怎么总是提取不出来啊？做SDS_PAGE总是没有条带

你做考马斯亮蓝染色看看有没有高表达条带

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生物-医药
10楼2016-01-08 15:40:14
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