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梦的金色城堡

新虫 (小有名气)

[求助] 有关大肠杆菌western bloting.做了两次了,还是膜上什么也没有 已有2人参与

做了蛋白iptg表达,用考马斯亮蓝染色,可是结果并不明显,我的目的蛋白是26.然后是做wb确定一下,用的半干转,DAB显色,但是我做了两次了还是没有任何条带,之前学妹做的其他蛋白,有条带出来,所以我用的东西应该没有问题。marker有条带,但是好像没有什么背景,也没有用内参,不知道是什么原因?是根本没有诱导出来,还是步骤错了,还是蛋白转过了还是没转上…?有没有懂的帮忙分析一下吧,谢谢,不胜感激~~失落中

有关大肠杆菌western bloting.做了两次了,还是膜上什么也没有


有关大肠杆菌western bloting.做了两次了,还是膜上什么也没有-1


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生物-医药
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黄腾

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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梦的金色城堡: 金币+2, 有帮助 2016-01-25 15:38:08
首先,marker出了条带,那就一定是转上了,26的分子量还是比较小,电泳时间可以再短一点,我是做也是做半干转的,确定一个内参再做还是比较好,你也可以确定一下抗体有没有问题,加一个确定已表达的样品做对照,或者是点一个合成蛋白样品,就是你们做抗体用的蛋白。

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3楼2016-01-05 19:00:21
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梦的金色城堡

新虫 (小有名气)

我的蛋白最靠近marker的那个是空白对照…

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生物-医药
2楼2016-01-04 22:37:38
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梦的金色城堡

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 黄腾 at 2016-01-05 19:00:21
首先,marker出了条带,那就一定是转上了,26的分子量还是比较小,电泳时间可以再短一点,我是做也是做半干转的,确定一个内参再做还是比较好,你也可以确定一下抗体有没有问题,加一个确定已表达的样品做对照,或者 ...

好的,谢谢你,我明天再做一次。我学妹的蛋白表达比较高,她也用的一抗1:1000,转45分钟,有条带。我的会不会是表达低所以没有呢?今天又配了一抗1:500打算试试,电转时间应该多少合适呢,蛋白26转了45分钟,marker正反面都有,会不会是转跑啦?

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生物-医药
4楼2016-01-05 20:28:25
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黄腾

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 梦的金色城堡 at 2016-01-05 20:28:25
好的,谢谢你,我明天再做一次。我学妹的蛋白表达比较高,她也用的一抗1:1000,转45分钟,有条带。我的会不会是表达低所以没有呢?今天又配了一抗1:500打算试试,电转时间应该多少合适呢,蛋白26转了45分钟,marke ...

你可以在一个泳道点一你学妹的样品,如果她的有条带而你的没有那就是没表达或没表达,marker不知道你用的是什么膜,一般是不会转到反面的
5楼2016-01-05 21:37:32
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wuchh123

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

6楼2016-01-06 09:49:26
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haze12344

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by wuchh123 at 2016-01-06 09:49:26
大肠杆菌的蛋白我怎么总是提取不出来啊?做SDS_PAGE总是没有条带

很好提啊,收菌后直接加2x loading溶解,再煮沸就可以上样了
生物你好
7楼2016-01-08 07:57:08
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wuchh123

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

8楼2016-01-08 11:58:25
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梦的金色城堡

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 黄腾 at 2016-01-05 21:37:32
你可以在一个泳道点一你学妹的样品,如果她的有条带而你的没有那就是没表达或没表达,marker不知道你用的是什么膜,一般是不会转到反面的...

点了学妹的,有条带了,今天才知道我是用错了菌…我们导师在美国,我用的是克隆载体,做了两个月了才发现…呜呜我要哭了。谢谢你了

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生物-医药
9楼2016-01-08 15:39:25
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梦的金色城堡

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by wuchh123 at 2016-01-06 09:49:26
大肠杆菌的蛋白我怎么总是提取不出来啊?做SDS_PAGE总是没有条带

你做考马斯亮蓝染色看看有没有高表达条带

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生物-医药
10楼2016-01-08 15:40:14
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