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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » i基因敲除需要的同源臂是越长效率越高吗？
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zrj123456

新虫 (小有名气)

[求助] i基因敲除需要的同源臂是越长效率越高吗？ 已有1人参与

同题，一直在做基因敲除，最近换了新方法，建议的同源臂是至少500bp，之前我构建了一个900bp的，怀疑是同源臂太长了，一直敲不出来，有可能吗？
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1楼 2015-12-28 16:15:48
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科学小覃

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zrj123456: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-12-29 14:56:33
用同源重组得方法做基因敲除，左右同源臂最好在1000bp以上，同源臂越长，重组率越高。也不要超过1600，太长质粒构建困难，测序也不方便，（目前质粒测序一般一个读长在700-800bp之间，若超过1600则又要重新设计测序引物）。
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生物科学
2楼2015-12-28 19:34:55
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zrj123456

新虫 (小有名气)
谢谢大神，那我现在敲不掉，为了提高效率是不是应该增加长度？可是为什么文献上同一种方法都是用的500bp左右？没有可能是越长效率越低吗？
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3楼2015-12-29 14:58:13
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子
结合转移也是同源重组，360bp左右也敲掉过。
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麻辣王子不爱做实验
4楼2015-12-29 18:34:34
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yq生活精灵

新虫 (正式写手)
看你用什么方法了

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5楼2015-12-29 18:36:26
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yguang

木虫 (职业作家)
用结合还是转化，做的什么菌都有关系，我用结合做细菌基因敲除同源臂一般1000-1500bp，用转化做酵母菌一般200-500bp。
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6楼2015-12-30 03:09:49
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zrj123456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zht930528 at 2015-12-29 18:34:34
结合转移也是同源重组，360bp左右也敲掉过。

那效率呢？是不是越长越高？
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7楼2015-12-30 09:24:13
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zrj123456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yq生活精灵 at 2015-12-29 18:36:26
看你用什么方法了

用的电转，类似于red系统的一套重组酶系统。
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8楼2015-12-30 09:26:01
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子
引用回帖:
7楼: Originally posted by zrj123456 at 2015-12-30 09:24:13
那效率呢？是不是越长越高？...

结合转移，重组质粒进去后，42℃消除质粒，挑选200.300个转化子就有了。

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麻辣王子不爱做实验
9楼2015-12-30 10:50:32
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adamhe

新虫 (初入文坛)
一般看你knock-in片段的长度，若是120bp以下，用ssDNA，同源臂一般50bp,效率比较高；若300bp左右，用片段的DNA就可以，同源臂一般200bp;超过500bp,一般同源臂500-1000bp,同源臂随着臂长高而效率高。讨论可以加452790462QQ
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10楼2016-01-26 12:41:32
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