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zrj123456

新虫 (小有名气)

[求助] i基因敲除需要的同源臂是越长效率越高吗?已有1人参与

同题,一直在做基因敲除,最近换了新方法,建议的同源臂是至少500bp,之前我构建了一个900bp的,怀疑是同源臂太长了,一直敲不出来,有可能吗?
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科学小覃

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zrj123456: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-12-29 14:56:33
用同源重组得方法做基因敲除,左右同源臂最好在1000bp以上,同源臂越长,重组率越高。也不要超过1600,太长质粒构建困难,测序也不方便,(目前质粒测序一般一个读长在700-800bp之间,若超过1600则又要重新设计测序引物)。
生物科学
2楼2015-12-28 19:34:55
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zrj123456

新虫 (小有名气)

谢谢大神,那我现在敲不掉,为了提高效率是不是应该增加长度?可是为什么文献上同一种方法都是用的500bp左右?没有可能是越长效率越低吗?
3楼2015-12-29 14:58:13
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子

结合转移也是同源重组,360bp左右也敲掉过。
麻辣王子不爱做实验
4楼2015-12-29 18:34:34
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yq生活精灵

新虫 (正式写手)

5楼2015-12-29 18:36:26
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yguang

木虫 (职业作家)

用结合还是转化,做的什么菌都有关系,我用结合做细菌基因敲除同源臂一般1000-1500bp,用转化做酵母菌一般200-500bp。
6楼2015-12-30 03:09:49
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zrj123456

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zht930528 at 2015-12-29 18:34:34
结合转移也是同源重组,360bp左右也敲掉过。

那效率呢?是不是越长越高?
7楼2015-12-30 09:24:13
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zrj123456

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by yq生活精灵 at 2015-12-29 18:36:26
看你用什么方法了

用的电转,类似于red系统的一套重组酶系统。
8楼2015-12-30 09:26:01
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子

引用回帖:
7楼: Originally posted by zrj123456 at 2015-12-30 09:24:13
那效率呢?是不是越长越高?...

结合转移,重组质粒进去后,42℃消除质粒,挑选200.300个转化子就有了。

发自小木虫Android客户端
麻辣王子不爱做实验
9楼2015-12-30 10:50:32
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adamhe

新虫 (初入文坛)

一般看你knock-in片段的长度,若是120bp以下,用ssDNA,同源臂一般50bp,效率比较高;若300bp左右,用片段的DNA就可以,同源臂一般200bp;超过500bp,一般同源臂500-1000bp,同源臂随着臂长高而效率高。讨论可以加452790462QQ
10楼2016-01-26 12:41:32
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