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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 病原/病毒 » 病毒plaque assay 不出现空斑！求助！
汕头大学海洋科学接受调剂
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zzzzs

新虫 (初入文坛)

[求助] 病毒plaque assay 不出现空斑！求助！ 已有2人参与

我用的病毒是AcNPV，具体实验步骤如下：
1. 把sf9细胞铺满整个六孔盘底部，吸走培养基，加入1ml病毒，浓度分别是10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，另外一个孔不加病毒作为对照，放入27度培养箱接种1h.
2.吸走病毒悬液后，盖上一层终浓度为1%的agar胶2ml (2X media+低熔点琼脂糖+10%FBS，低熔点琼脂糖和2X medium各一半)，温度保持在45度左右，保证细胞不被烫死。
3.待agar凝固后，在加入1ml新鲜细胞培养基（无FBS），保证细胞的存活
4.28度细胞培养箱5天之后观察

可以在接种高浓度病毒悬液中看到多角体，但是没有形成空斑，到底是哪个步骤出错了，请大神指教！~~~谢谢！
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1楼 2015-12-28 15:16:48
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bibiwenbi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zzzzs: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-01-04 16:41:25
你有用细胞染色液入染色看空斑的形成吗？比如用中性红染色液？你的实验目的是什么？是检测病毒滴度吗？还是为了做空斑纯化？

如果是根据多角体的形成判断空斑的话，5天估计还不足以形成足够大的空斑。如果你的接种浓度太高的话，也不会形成空斑，而形成一片一片的感染细胞。要形成空斑的话，病毒接种量要小到MOI=0.01--0.001之间。
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2楼2015-12-29 20:22:57
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zzzzs

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bibiwenbi at 2015-12-29 20:22:57
你有用细胞染色液入染色看空斑的形成吗？比如用中性红染色液？你的实验目的是什么？是检测病毒滴度吗？还是为了做空斑纯化？

如果是根据多角体的形成判断空斑的话，5天估计还不足以形成足够大的空斑。如果你的接 ...

谢谢！实验的目的是检测病毒滴度
我先是把6孔盘往上45度对着强光看，5天的时候看底部是一层细胞，完全没有看到空斑的任何迹象，然后用含有中性红的agar染色，也看不到空斑，实验的时候我应该注意什么问题？
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3楼2016-01-04 16:40:27
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bibiwenbi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zzzzs at 2016-01-04 16:40:27
谢谢！实验的目的是检测病毒滴度
我先是把6孔盘往上45度对着强光看，5天的时候看底部是一层细胞，完全没有看到空斑的任何迹象，然后用含有中性红的agar染色，也看不到空斑，实验的时候我应该注意什么问题？...

首先你能确定细胞被病毒感染上了吗？

如果细胞没有被感染上，那么你做空斑实验的时候病毒就不要稀释得太多，-1，-2稀释度都应该做一下。

如果细胞被感染上了，那看不到空斑是什么意思？是被病毒感染上的细胞都连成了一大片这样子吗？如果这样子的话就应该对病毒继续稀释。

如果中性红染不出空斑的话，那么细胞应该都是健康的，也就是说你的病毒滴度肯定很低，没有对细胞感染上。
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4楼2016-01-12 11:05:01
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zzzzs

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bibiwenbi at 2016-01-12 11:05:01
首先你能确定细胞被病毒感染上了吗？

如果细胞没有被感染上，那么你做空斑实验的时候病毒就不要稀释得太多，-1，-2稀释度都应该做一下。

如果细胞被感染上了，那看不到空斑是什么意思？是被病毒感染上的细胞 ...

感谢！杆状病毒空斑实验已经做出来了，谢谢大神帮助！
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5楼2016-01-23 13:50:30
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燕子1314

金虫 (初入文坛)
能不能给我发个详细的步骤，急用 ！！！谢谢
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6楼2016-05-23 17:17:46
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zoebio

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

您好，我目前在做中性红蚀斑法，细胞也是健康的，但就是不出空斑，请问你在哪些实验步骤做出改变，使得你的实验成功的？谢谢。
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7楼2016-11-22 11:14:27
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