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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

[求助] 3'RACE 求助 已有1人参与

最近在扩3‘,但是因为没有完整的ORF,所以导致3’略长,分别设计内外引物做降落PCR。。。可是都扩不出来,求大神是什么原因啊
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

是要重新设计引物?还是再扩一段,然后再做RACE
2楼2015-12-25 11:40:29
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xygcdmr

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
凯伦爱佳佳: 金币+5, 有帮助 2015-12-26 12:09:57
3‘RACE 一般很好做的。有预测大概的长度吗?先确定RNA, 反转录,引物都没问题,可能是3’端比较长,延伸时间不够吧。最后再考虑用降落PCR
3楼2015-12-25 21:41:53
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xygcdmr at 2015-12-25 21:41:53
3‘RACE 一般很好做的。有预测大概的长度吗?先确定RNA, 反转录,引物都没问题,可能是3’端比较长,延伸时间不够吧。最后再考虑用降落PCR

最长的有1500bp。。。我直接用的降落PCR
那设计引物有什么特别要求么?
4楼2015-12-25 22:59:03
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xygcdmr

木虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2015-12-25 22:59:03
最长的有1500bp。。。我直接用的降落PCR
那设计引物有什么特别要求么?...

如果条带多的话退火温度可以高一些65-68也是可以的,如果没有条带就要降低引物的退火温度啦。预测1500?有可能3‘end 更长,增加延伸时间试试吧
5楼2015-12-26 11:57:03
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by xygcdmr at 2015-12-26 11:57:03
如果条带多的话退火温度可以高一些65-68也是可以的,如果没有条带就要降低引物的退火温度啦。预测1500?有可能3‘end 更长,增加延伸时间试试吧...

没有条带,我又重新设计了引物再做。。。我再摸索一下吧
6楼2015-12-26 12:09:39
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humaoer00112

新虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2015-12-26 12:09:39
没有条带,我又重新设计了引物再做。。。我再摸索一下吧...

楼主现在怎么样了?我也是没有出条带,因为目的片段过大,我在考虑换个酶试一试,我也是搞水产的,可以多多交流
7楼2015-12-27 15:03:45
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by humaoer00112 at 2015-12-27 15:03:45
楼主现在怎么样了?我也是没有出条带,因为目的片段过大,我在考虑换个酶试一试,我也是搞水产的,可以多多交流...

我都快醉了。。。我一直用的r-taq酶,降落PCR,一直搞不定
8楼2015-12-27 22:04:50
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804371539

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xygcdmr at 2015-12-25 21:41:53
3‘RACE 一般很好做的。有预测大概的长度吗?先确定RNA, 反转录,引物都没问题,可能是3’端比较长,延伸时间不够吧。最后再考虑用降落PCR

反转录用的什么试剂盒呢?
9楼2016-03-18 10:38:07
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loveqingzhi

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2015-12-27 22:04:50
我都快醉了。。。我一直用的r-taq酶,降落PCR,一直搞不定...

现在做出来了吗  想请教你啊
10楼2016-08-23 13:35:15
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