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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 3'RACE 求助
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

[求助] 3'RACE 求助 已有1人参与

最近在扩3‘，但是因为没有完整的ORF，所以导致3’略长，分别设计内外引物做降落PCR。。。可是都扩不出来，求大神是什么原因啊
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1楼 2015-12-24 22:55:54
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
是要重新设计引物？还是再扩一段，然后再做RACE
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2楼2015-12-25 11:40:29
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xygcdmr

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
凯伦爱佳佳: 金币+5, ★有帮助 2015-12-26 12:09:57
3‘RACE 一般很好做的。有预测大概的长度吗？先确定RNA, 反转录，引物都没问题，可能是3’端比较长，延伸时间不够吧。最后再考虑用降落PCR
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3楼2015-12-25 21:41:53
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xygcdmr at 2015-12-25 21:41:53
3‘RACE 一般很好做的。有预测大概的长度吗？先确定RNA, 反转录，引物都没问题，可能是3’端比较长，延伸时间不够吧。最后再考虑用降落PCR

最长的有1500bp。。。我直接用的降落PCR
那设计引物有什么特别要求么？
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4楼2015-12-25 22:59:03
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xygcdmr

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2015-12-25 22:59:03
最长的有1500bp。。。我直接用的降落PCR
那设计引物有什么特别要求么？...

如果条带多的话退火温度可以高一些65-68也是可以的，如果没有条带就要降低引物的退火温度啦。预测1500？有可能3‘end 更长，增加延伸时间试试吧
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5楼2015-12-26 11:57:03
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xygcdmr at 2015-12-26 11:57:03
如果条带多的话退火温度可以高一些65-68也是可以的，如果没有条带就要降低引物的退火温度啦。预测1500？有可能3‘end 更长，增加延伸时间试试吧...

没有条带，我又重新设计了引物再做。。。我再摸索一下吧
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6楼2015-12-26 12:09:39
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humaoer00112

新虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2015-12-26 12:09:39
没有条带，我又重新设计了引物再做。。。我再摸索一下吧...

楼主现在怎么样了？我也是没有出条带，因为目的片段过大，我在考虑换个酶试一试，我也是搞水产的，可以多多交流
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7楼2015-12-27 15:03:45
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by humaoer00112 at 2015-12-27 15:03:45
楼主现在怎么样了？我也是没有出条带，因为目的片段过大，我在考虑换个酶试一试，我也是搞水产的，可以多多交流...

我都快醉了。。。我一直用的r-taq酶，降落PCR，一直搞不定
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8楼2015-12-27 22:04:50
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804371539

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xygcdmr at 2015-12-25 21:41:53
3‘RACE 一般很好做的。有预测大概的长度吗？先确定RNA, 反转录，引物都没问题，可能是3’端比较长，延伸时间不够吧。最后再考虑用降落PCR

反转录用的什么试剂盒呢？
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9楼2016-03-18 10:38:07
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loveqingzhi

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2015-12-27 22:04:50
我都快醉了。。。我一直用的r-taq酶，降落PCR，一直搞不定...

现在做出来了吗  想请教你啊
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10楼2016-08-23 13:35:15
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