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love犬夜叉

木虫 (小有名气)

[求助] 重叠延伸PCR后重组菌测序老是失败

如题,利用重叠延伸PCR突变后连接到pet28a质粒,转入BL21(DE3)中,将菌落PCR呈阳性的菌落提质粒,质粒大小与未突变的工程菌质粒大小一致,使用质粒PCR也呈阳性(通用T7引物及特异性引物都有验证),开始只送菌液测序失败,后来菌液及质粒都有送测,结果还是失败,以为是送测的菌不纯,所以又划线挑单菌落送测(PCR及提质粒验证过),结果还是失败= =!下图是最近一次测序的峰图,请大家帮忙分析下原因,卡在这好久了= =!

重叠延伸PCR后重组菌测序老是失败
搜狗截图20151218132946.png
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justloveinuyasha
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喵喵小猫鱼

新虫 (初入文坛)

之前我也遇到这种情况来着,老师说就是运气不好,后来证明确实是运气不好...也有可能是测序的问题
2楼2016-04-07 20:52:46
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匿名

用户注销 (正式写手)

本帖仅楼主可见
3楼2016-04-09 08:18:11
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love犬夜叉

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 喵喵小猫鱼 at 2016-04-07 20:52:46
之前我也遇到这种情况来着,老师说就是运气不好,后来证明确实是运气不好...也有可能是测序的问题

换了几家测序公司,都是,不过后来重新连接,PCR验证阳性的测序不正确,没条带的验证正确,我也是醉了
justloveinuyasha
4楼2016-04-15 11:55:28
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love犬夜叉

木虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 青蛙快飞 at 2016-04-09 08:18:11
直接连表达载体么。。

是的
justloveinuyasha
5楼2016-04-15 11:55:36
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匿名

用户注销 (正式写手)

本帖仅楼主可见
6楼2016-04-15 15:07:01
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王冠傑

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 青蛙快飞 at 2016-04-15 15:07:01
测序公司也是用通用引物单向测的,所以测的有空载的杂峰带。应该是菌有问题,你用特异性引物测过么?

这个峰图是没信号,没啥意义也不是杂峰,建议用通用引物pcr之后送pcr产物测序,验证无误就接着做,有问题再分析,这样快。

发自小木虫IOS客户端
7楼2016-04-16 04:22:04
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