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xuehu2008铜虫 (正式写手)
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[交流]
求教高手关于RT-PCR
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我最近克隆一个人源的蛋白，我以前没有做过真核的分子克隆，所以感觉没有头绪，现在求教高手以下几个问题： 1.是先用oligo（dT）作随机引物从总的RNA 上扩增出总的cDNA后再以此为模板设计目的基因引物扩增目的片断呢还是直接从总RNA上扩增目的cDNA 好一些？ 2.针对目的基因的特异性引物应该怎样设计？ 3.有没有试剂盒可以完成一部法的RT-PCR?如果有，哪一家公司的性价比高一些？ 4.关于总RNA的提取，网上说的Trizol法是手提呢还是试剂盒操作？ 5.我看论坛上有人说所用试剂盒是合成第一链cDNA用的，有没有可以合成双链的？ 初次做这个，问题比较笨，还望大侠们不吝赐教。 |
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2楼2008-09-21 14:06:51
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1 都一样.但建议先用oligo或随机引物,然后再目的.这样RT product还可以干别的用;或者一旦目的片段引物设计不佳 还有更改的余地. 2 引物设计很多方法.不过重要的是你要理解目的基因的结构,那里是起始密码子,终止密码子;以及所用载体的结构, 牢记:读码框一定对好,呵呵! 3 同意楼上的,另外promega也行. 4 Trizol是一个专利产品, 做了优化,使提取更简单. 谈不上手提还是kit, trizol本身就是kit, 5 RT就是第一条联,. 你多目的片段来自PCR,模板是RT product. gooood lucky!!希望对你有帮助.呵呵 |
3楼2008-09-21 14:42:43
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| 对了，在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/bl2seq/wblast2.cgi中，我把那39个碱基分别复制在Sequence1和Sequence2栏中，为什么比对的结果竟然是No significant similarity was found ，为什么呢？ |
7楼2008-09-21 22:28:42
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9楼2008-09-22 00:15:56
