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新虫 (初入文坛)

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[交流] RT-PCR实时荧光定量PCR详细过程已有2人参与

Real-Time PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，利用荧光信号的实时变化检测PCR扩增反应中每一个循环扩增物量的变化，最后通过Ct值和标准曲线的关系，并结合相应的软件对未知模板进行相对或绝对定量的方法。
实验流程：
1、设计并合成Real-Time PCR引物
2、引物溶解后使用TaqDNA聚合酶进行SG PCR反应
3、客户样品RNA抽提
原装进口TRIZOL试剂进行样品RNA匀浆抽提
4、RNA质量检测
将抽提RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测抽提RNA纯度及完整性
5、使用原装进口逆转录酶将RNA逆转录为cDNA
6、制作标准曲线样品
进行相对定量，需要先将样品的目的基因及管家基因进行扩增，其产物进行梯度稀释用作标准曲线
7、标准曲线样品和待测样品分别加入到含有SG的RT-PCR反应液中，进行RT-PCR扩增
8、检测结果进行标准曲线分析
以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以矫正误差，所得结果为某样品目的基因的相对含量。
南京百世金生物技术有限公司

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