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在玻璃片上的抗体修饰 已有2人参与
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我打算在玻璃片上修饰抗体，做法按照文献中：首先清洗玻璃片，并在食人鱼洗液中进行浸泡，进行羟基化，拿出后用去离子水冲洗，在空气中自然干燥（之前我也放到烘箱里干燥或者用吹风机吹干的，我看有些是用高纯氮气吹干，不知道这个有什么影响吗？），首先用4%（v/v）MPTS(3-巯丙基三甲氧基硅烷(MPTS))/乙醇中，滴到玻璃片上，自然干燥，再加上GMBS(N-(4-Maleimidobutyryloxy)succinimide)/DMSO，反应的浓度文献中各有不同 ，我用的大概是一个比较低的浓度，这层液体不容易干，一般我都反应半个小时，将液体倒掉，再等干燥，在加上链霉亲和素/PBS，反应一般是在室温下反应30-60min,再放入冰箱4度过夜，第二天拿出加入生物素化的抗体。整个反应都是室温下进行的，反应时间都是在30min 以上，文献中的反应温度写的是室温，反应时间是30-45min ,也有的文献写加入链霉亲和素那步骤反应过夜的（少数提到），不知道我这个实验过程有什么不对吗，最后做的效果不好，还有这每一步的反应可以表征吗（比如红外？）目前实验停滞于此，很纠结啊，无法进行啊，有做过或了解的前辈可否指点一下。 （最后拿这个修饰的玻璃片去捕获肿瘤细胞了，没有效果的） 我考虑到的原因 1.GMBS我溶在DMSO中后，开始放在4度里，但冻了，我就拿出来放室温了，我刚把每个药品仔细查了，GMBS的说明上写储存在0-5度，是不是GMBS 已经变质了？ 2.抗体我按文献稀释在了PBS中，加了BSA和叠氮钠，存放在4度里了，这样时间长了是不是抗体就失去活性了？叠氮钠会影响生物素-亲和素的反应？ 3.GMBS的说明书写反应温度30-37摄氏度，是不是室温20摄氏度左右影响反应 4.是不是整个反应中的室温反应都应该提高的37摄氏度 5.食人鱼洗液处理羟基化不足，或者在空气下破坏了？（这么脆弱？） |
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甘草半夏: 金币+10, ★有帮助 2015-12-03 10:46:47
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一篇很相似的文章，传不了附件 Section 1: Aminosilylate the Glass Surface 1. Thoroughly wash and dry the glass, silica or quartz surface to be coated. Note: Perform Steps 2 and 3 in a fume hood. 2. Prepare a 2% solution of the Aminosilane Reagent (3-Aminopropyltriethoxysilane) in acetone. For example, mix 1 part Aminosilane Reagent with 49 parts dry (i.e., water-free) acetone. Prepare a volume sufficient to immerse or cover the surface material. 3. Immerse surface in the diluted reagent for 30 seconds. 4. Rinse surface with dry acetone. 5. Allow surface to air-dry. Note: The dried silylated surface may be stored for later use. Section 2: Maleimide-Activate the Amino-Modified Surface 1. Add 2 mg Crosslinker (Sulfo-SMCC) to 1 ml Coupling Buffer. This solution may be scaled as needed, and must be used immediately to avoid hydrolysis. 2. Cover silylated surface with the Crosslinker solution. 3. Incubate for 1 hour at room temperature (RT). 4. Rinse the modified surface with Coupling Buffer. Note: The maleimide-activated surface may be dried and stored desiccated at 4°C for later use. |
3楼2015-12-02 15:48:32
4楼2015-12-07 13:27:01
