| 查看: 536 | 回复: 8 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
做基因的高手帮忙看看啊
|
|||
|
我设计的引物如下：CCGTAGCCATATG……………………………… GCGCGAATTC……………………………………… 下划线分别为NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点，酶切位点后的碱基省略了。因为Ndel酶切效率低，我用了7个保护碱基。 PCR能扩增出目的基因（约1000bp），且电泳只有一条带，没有杂带。之后用UNIQ10柱式PCR产物纯化试剂盒回收PCR产物。质粒用的是PET-28a，对目的DNA和PET-28a分别双酶切，酶切体系如下; 10×bufferO 5μl, ddH2O 31μl, DNA 10μl, Ndel/EcoRl各2μl，共50μl 然后用UNIQ10柱式胶回收试剂盒对酶切产物纯化。 之后在16℃条件下连接过夜，连接体系如下：10×T4DNA连接buffer 2μl, ddH2O 6μl, PEG4000 2μl, 酶切目的基因 6μl, PET-28a 2μl, T4DNA连接酶2μl，共20μl 宿主细胞用的是DH5α, 用CaCl2法制备感受态细胞200μl/支，然后热激法转化，用的Kanr LB平板筛选重组菌，卡那霉素终浓度100μg/ml, 平板上长出的菌落很少，多的时候有20~30个，少的时候就1~4个，然后挑取单菌落，提质粒，经过PCR和双酶切鉴定都只是空质粒，目的基因片段没有转进去。实验过程我重复做了多次都是这样，请做克隆的高手帮忙分析一下问题可能出在那些地方，谢谢了！ |
回复此楼» 猜你喜欢
289求调剂
已经有6人回复
-
291求调剂
已经有17人回复
-
材料与化工085600，总分304，本科有两篇sci参与，求调剂
已经有12人回复
-
277跪求调剂
已经有7人回复
-
一志愿北京化工大学 070300 学硕 336分 求调剂
已经有9人回复
-
求调剂推荐 材料 304
已经有13人回复
-
07化学280分求调剂
已经有10人回复
-
考研调剂
已经有3人回复
-
材料292调剂
已经有12人回复
-
化学调剂
已经有4人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
7楼2008-09-19 10:07:32
qgaoamtf
至尊木虫 (职业作家)
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 13397.4
- 散金: 1937
- 红花: 5
- 帖子: 4119
- 在线: 903.4小时
- 虫号: 447303
- 注册: 2007-10-31
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传育种学
2楼2008-09-18 22:44:58
克隆大虾
铁杆木虫 (著名写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 133 (高中生)
- 金币: 6010.9
- 散金: 236
- 红花: 10
- 帖子: 2367
- 在线: 1337.3小时
- 虫号: 93868
- 注册: 2005-09-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
3楼2008-09-19 07:18:29
4楼2008-09-19 08:20:01
