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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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江枫渔火

铜虫 (小有名气)

[交流] 做基因的高手帮忙看看啊

我设计的引物如下:CCGTAGCCATATG………………………………
GCGCGAATTC………………………………………
下划线分别为NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点,酶切位点后的碱基省略了。因为Ndel酶切效率低,我用了7个保护碱基。
PCR能扩增出目的基因(约1000bp),且电泳只有一条带,没有杂带。之后用UNIQ10柱式PCR产物纯化试剂盒回收PCR产物。质粒用的是PET-28a,对目的DNA和PET-28a分别双酶切,酶切体系如下;
10×bufferO 5μl,  ddH2O 31μl,  DNA 10μl,  Ndel/EcoRl各2μl,共50μl
然后用UNIQ10柱式胶回收试剂盒对酶切产物纯化。
之后在16℃条件下连接过夜,连接体系如下:10×T4DNA连接buffer 2μl,  ddH2O  6μl,   PEG4000 2μl,  酶切目的基因 6μl,  PET-28a  2μl,  T4DNA连接酶2μl,共20μl
宿主细胞用的是DH5α, 用CaCl2法制备感受态细胞200μl/支,然后热激法转化,用的Kanr  LB平板筛选重组菌,卡那霉素终浓度100μg/ml, 平板上长出的菌落很少,多的时候有20~30个,少的时候就1~4个,然后挑取单菌落,提质粒,经过PCR和双酶切鉴定都只是空质粒,目的基因片段没有转进去。实验过程我重复做了多次都是这样,请做克隆的高手帮忙分析一下问题可能出在那些地方,谢谢了!
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qgaoamtf

至尊木虫 (职业作家)

★ ★ ★
司马诸葛(金币+3,VIP+0):谢谢交流 7-14 12:23
1. 引物合成酶切位点有误,我实验室发生过一起;建议先用Tag酶作PCR,再将PCR产物连接到T载体测序确定。
2. PCR产物与PET-28a的浓度比应在1:3-1:10.
3. 酶切体系中至少EcoRl浓度过高,不要超过1μl。
4. PET-28a酶切产物去磷酸化,防止自连。
5. 其他原因,如Ndel失活等,可考虑分别酶切。
2楼2008-09-18 22:44:58
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

呵呵

★ ★
司马诸葛(金币+2,VIP+0):谢谢交流 7-14 12:23
连接时,用的哪个公司的连接酶?
1kb应该不难连接啊。常规的PEG4000应该可以不加的
酶切可以分开切,尤其是质粒,我一般EcoRI切1-2h,回收,再用NdeI酶切。PCR产物我一般双酶切,你应该用的fermentas的酶,buffer O也是对的。
3楼2008-09-19 07:18:29
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xipha

木虫 (正式写手)

质粒没切开,酶切体系中减少质粒的量
4楼2008-09-19 08:20:01
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shuchang

金虫 (初入文坛)


司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 7-14 12:23
为了保险起见,你可以将质粒单切后胶回收,然后用第二个酶切后,柱式回收。
20微升体系1微升连接酶足够了
连接反应时最好设个负对照

[ Last edited by shuchang on 2008-9-19 at 08:48 ]
5楼2008-09-19 08:46:32
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sumertansy

铜虫 (小有名气)


司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 7-14 12:22
PCR产物先克隆到T载体,然后用NdeⅠ和EcoRⅠ消化回收目标片段,和相应酶消化的pET-28a连接。如果蓝斑很多,说明载体消化的不好。在这个过程中可以排除目标片段的问题了。如果转化后菌落很少,那么就要考虑你的载体的质量和转化操作了。
6楼2008-09-19 09:45:10
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江枫渔火

铜虫 (小有名气)

各位的建议很好,我会尝试着做看看的
7楼2008-09-19 10:07:32
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yierangel

金虫 (小有名气)

楼主的感受态细胞检测过活性没有啊?也有可能是感受态细胞污染啊
8楼2008-09-19 10:13:23
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江枫渔火

铜虫 (小有名气)

今天我在Kana平板上挑取了2个重组菌提质粒,电泳以原始质粒PET-28a为对照,发现这两个质粒比原始质粒明显跑得快,这应该能说明质粒酶切切开了,而约1000bp的外源DNA没连接上,所以我现在考虑是不是连接酶失活了,不知还有没有其它可能的原因,请高手帮忙分析下。
9楼2008-09-19 18:20:09
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