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做基因的高手帮忙看看啊
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我设计的引物如下：CCGTAGCCATATG……………………………… GCGCGAATTC……………………………………… 下划线分别为NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点，酶切位点后的碱基省略了。因为Ndel酶切效率低，我用了7个保护碱基。 PCR能扩增出目的基因（约1000bp），且电泳只有一条带，没有杂带。之后用UNIQ10柱式PCR产物纯化试剂盒回收PCR产物。质粒用的是PET-28a，对目的DNA和PET-28a分别双酶切，酶切体系如下; 10×bufferO 5μl, ddH2O 31μl, DNA 10μl, Ndel/EcoRl各2μl，共50μl 然后用UNIQ10柱式胶回收试剂盒对酶切产物纯化。 之后在16℃条件下连接过夜，连接体系如下：10×T4DNA连接buffer 2μl, ddH2O 6μl, PEG4000 2μl, 酶切目的基因 6μl, PET-28a 2μl, T4DNA连接酶2μl，共20μl 宿主细胞用的是DH5α, 用CaCl2法制备感受态细胞200μl/支，然后热激法转化，用的Kanr LB平板筛选重组菌，卡那霉素终浓度100μg/ml, 平板上长出的菌落很少，多的时候有20~30个，少的时候就1~4个，然后挑取单菌落，提质粒，经过PCR和双酶切鉴定都只是空质粒，目的基因片段没有转进去。实验过程我重复做了多次都是这样，请做克隆的高手帮忙分析一下问题可能出在那些地方，谢谢了！ |
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