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[交流] 长生的仙草--PacBio第三代测序技术Nature最新文章解读

Oropetium，属于禾本科，是目前已知最小基因组的草类，基因组大小为245M，基因组虽小却变化多端，具有28,466个编码蛋白基因和43%的重复序列，还有30%以上更紧凑的常染色体区域。使用常规NGS测序数据进行拼接，简直就是不可能的任务。

幸运的是，来自唐纳德植物科学中心的 Robert VanBuren, Doug Bryant以及Todd Mockler以及来自于加州大学伯克利分校等单位的研究者，2014年成为了由PacBio公司赞助的“世界上最有趣基因组项目““Most Interesting Genome in the World” SMRT Grant Program的获奖者，该项目由Pacific Biosciences公司和Sage Science共同发起。Pacific Biosciences公司承担了其中的第三代测序和基因图谱绘制工作。
重大突破：
      2015年11月11日，Nature杂志在线发表了他们的文章：Single-molecule sequencing of the desiccationtolerant grass Oropetium thomaeum，基于Pacific Biosciences公司的第三代单分子测序技术独立测序，并结合Bionano单分子光学图谱技术，获得几乎完整的耐旱草Oropetium thomaeum基因组。
   本文完全采用第三代单分子测序技术，基于P6-C4试剂，用32个 SMRT cells在RS II系统上运行，测序时间不到一周，产生了覆盖72×Oropetium基因组的序列。获得了Read N50>16kb的长度长，拼接得到Oropetium 基因组的99%（244Mb），共组装成625个contigs，Contig N50达到2.4Mb（而目前已发表的所有植物基因组Contig N50平均大小仅为50kb）。其中35个最大的Contigs覆盖了一半的基因组，107个Contig就已包含了90%的基因组序列。
   作者轻松组装得到了Oropetium“几乎完整”的基因组草图。包括无Gap覆盖基因区域和基因间序列，比如着丝粒，端粒，转座子及rRNA簇等区域，这些区域在以往的草图中都是典型的无法拼接的区域。仅仅72x，测序的准确率就高达99.99995%，和经典的Sanger法相似，高于大部分基于NGS数据拼接的准确性。
其中全长为135,324bp的叶绿体基因组被拼接为一个单独的Contig，其中还包含两个25kb长的反向重复区域，这在以往的NGS测序拼接中都被误认为是一个拷贝。
Oropetium基因组的组装还获得了所有的18个端粒区序列。这一区域有40-900个不等的重复序列，9个着丝粒区域中的3个也被完整拼接到400kb的超长反向重复序列中，这其中包含155bp的重复单元单体，或2倍，3倍或4倍的重复单元。

Oropetium基因组的完成充分证明，采用PacBioSMRT 单分子实时测序技术和BioNano单分子基因组图谱绘制系统，可以完成前所未有的高质量基因组。
作者在文中指出，该项目从DNA提取到获得完整基因组组装只用了不到一个月，PacBio成本与基于Illumina的基因组组装也是接近的。PacBio SMRT测序可以获得全新的高质量基因组组装，并用于基因间序列的完整ENCODE类型分析，这对于其他基于NGS的方法是不可能的。
应用价值：
该物种完整基因组的完成，同时也为比较基因组学研究提供了非常有价值的资源。
禾本科（学名：Poaceae）是最主要的植物大科之一，有660属近10000种，是种子植物中最有经济价值的大科，与人们的生活息息相关，比如：小麦、稻米、玉米、大麦、高粱等，是人类粮食和牲畜饲料的主要来源。在生态上，禾本科植物适应性广，分布遍及全球，从热带至寒带，从平原到高山，湖泊、沼泽、沙漠地区均有它们的踪迹，居高等植物之冠。

   上图就是文章中对禾本科的多个属，进行进化树分析，包括高粱属，稻属，短柄草属进行了比对，Oropetium基因组更为紧凑，重复区域更少，以基因组数据比对进行的种属分类就更为准确，Oropetium的优良抗逆性能也可以在跨物种作物育种中得到利用。
测序常识：
1.什么是Reads?
   高通量测序平台产生的原始序列就称为reads。
2. 什么是Contig？
   拼接软件基于reads之间的overlap重叠区，拼接获得的序列称为Contig（重叠群）。Contig就是完全用序列拼接出来的，中间没有缺失，但不代表没有数量和位置上的错误。基于二代测序技术测序片段较短，很难拼出长序列，为了克服这个问题，需要使用3k/ 5k /10k /20k不同长度的文库，构建大片段，再把大片段两端100bp序列进行测序定位，这样把Contig给拼接起来。
3.何谓N50？
   N50就是50%的序列中最短的那条序列长度，把序列按长到短排序，累计相加，当累计长度达到拼接基因组大小50%的时候，这一条序列是多长，那就是N50。这个对于Contig 和Scaffold适用，所以经常看到Contig N50 和Scaffold N50，这两个指标越大表示基因组组装的越好，其间的Gap越少。

4.什么是Scaffold？
基因组de novo从头测序，通过reads拼接获得Contigs后，往往还需要构建更大的文库，以获得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）两端的序列。基于这些序列，可以确定一些Contig之间的顺序关系，这些先后顺序已知的Contigs组成Scaffold。对于动物来说，一般可以达到2M级别，植物很多只有几十K左右。
5.PacBio三代测序解决问题的意义？
PacBio SMRT三代单分子测序技术平均读长能达到16Kb，对于如简单重复序列，回文序列，反向重复，转座子等NGS技术发现不了或者不能定位的基因结构变异区域，直接测通，减少了拼接过程带来的错误，而且可以覆盖如高G/C含量等NGS技术的盲区，所以Contig N50就能达到之前NGS技术的Scaffold效果，甚至更好。所以如这篇文章报道的，其Contig N50就达到了2.4M。
PacBioSMRT第三代测序技术如此强悍，相信不久的未来，大量的基于PacBio三代技术的高质量基因组数据会不断涌现。
Pacbio在中国
天津生物芯片于2013年引进国内首批PacBio RS II测序仪系统，将PacBio RS II测序平台与二代测序平台相结合，目前可以达到平均8K以上的读长，它应用于小基因组完成图、动植物复杂基因组组装、表观基因组学、全长转录组测序等方面。2014年，率先升级至P6-C4试剂盒，读长高达42Kb，reads N50高达18Kb，每个SMRT Cell的数据量高达1.2Gb，碱基准确度>99.999%（QV50）。在这两年时间里，天津生物芯片通过上百个大小项目的实战经验积累，进一步优化和完善了自己基于第三代测序的数据分析平台，成为第三代测序分析服务领域领跑者。某二倍体基因组大小为350Mb左右，且杂合度比较高。天津生物芯片使用P6-C4试剂组合，测其全基因组DNA。最终测得subreads的总数据量为30.4Gb，经过过滤的subreads长度的N5O值为15450bp，subreads的平均长度为11054bp。采用TBC研发的拼接策略仅用Pacbio进行denovo拼接，最终获得了321Mb基因组序列，最终拼接结果的Contig N50值达1.35mb。

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