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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 指状青霉菌丝扫描电镜样品前处理
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vivi3168

新虫 (小有名气)

[求助] 指状青霉菌丝扫描电镜样品前处理已有2人参与

实验需要用扫描电镜观察抑菌剂处理过的指状青霉菌丝表面形态的变化，我用的是PDA固体培养基培养的菌种，文献上说是从菌落边缘取一菌饼，放入2.5%的戊二醛中固定，然后PBS漂洗、梯度乙醇脱水、再干燥，我不明白这个菌饼的取法，是连带着培养基也取出吗？PBS漂洗是离心还是只是冲洗几遍？我想烘干或自然晾干，如果带着培养基的话，培养基会有残留吧？电镜小白求指导啊。。。。。。。
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1楼2015-11-19 09:05:33
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lark001

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根据楼主的问题，下面几点可作参考：
（1）“PDA固体培养基培养的菌种，文献上说是从菌落边缘取一菌饼”，个人认为是用接种环在菌落上刮取菌体，轻轻地、尽量不刮到培养基；液体培养基的话，高速离心，弃去培养基即可；
（2）PBS漂洗：这是为了去除上一步的固定液，可以冲洗，也可以加入PBS，轻轻振荡，混合后，再弃去PBS；
（3）经过梯度脱水后，是可以自然晾干的，这样会比较慢，可以将其放置于接种台，打开风扇，会快一些；当然用临界点干燥更好。
祝实验顺利！
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2楼2015-11-19 09:44:04
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vivi3168

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lark001 at 2015-11-19 09:44:04
根据楼主的问题，下面几点可作参考：
（1）“PDA固体培养基培养的菌种，文献上说是从菌落边缘取一菌饼”，个人认为是用接种环在菌落上刮取菌体，轻轻地、尽量不刮到培养基；液体培养基的话，高速离心，弃去培养基即 ...

谢谢亲回复~我也想过用液体培养基，不过菌丝会相互缠绕成小球，不知道这个会不会影响电镜观察？培养初期形成片状，可否取这个时期的菌丝？还有一个问题，是否可以省略乙醇脱水这步然后向你说的那样直接风干？看也有文献是这样做的。。。帮忙指点一下吧
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3楼2015-11-19 13:11:06
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草溪河

铁虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先取样时在菌落边缘连同培养基切成1-2 X 5 mm大小的样块，最好保持菌块原样，否则会影响菌丝形态。样品处理过程不会用到离心机，漂洗就是用PBS浸泡，将样品中的溶液置换成PBS，包括之后的梯度脱水和乙酸异戊酯置换，之后直接用吸管或移液枪直接吸出即可。干燥是指用CO2临界点干燥，除去样品中的水分。之后再经喷金镀膜后就可以上机看了。一般情况下，电镜室应该有负责的老师可以请教和制样方法参考。
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4楼2015-11-19 22:55:35
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vivi3168

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 草溪河 at 2015-11-19 22:55:35
首先取样时在菌落边缘连同培养基切成1-2 X 5 mm大小的样块，最好保持菌块原样，否则会影响菌丝形态。样品处理过程不会用到离心机，漂洗就是用PBS浸泡，将样品中的溶液置换成PBS，包括之后的梯度脱水和乙酸异戊酯置换 ...

最后一步临界点干燥，因为没有相应的干燥仪器，是否可以晾干或风干？
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5楼2015-11-22 09:44:33
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草溪河

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by vivi3168 at 2015-11-22 09:44:33
最后一步临界点干燥，因为没有相应的干燥仪器，是否可以晾干或风干？...

实在不行，也就那样吧。不过，那样的话可能会影响成像效果。你那的扫描多用于观察什么的呀？一般生物用时都会配置干燥仪的。

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6楼2015-11-22 09:58:55
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vivi3168

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 草溪河 at 2015-11-22 09:58:55
实在不行，也就那样吧。不过，那样的话可能会影响成像效果。你那的扫描多用于观察什么的呀？一般生物用时都会配置干燥仪的。
...

我们的扫描电镜是学校的，而且学校老师不管样品前处理，拿过去的就是要干燥好的。。。。对了，还有一个小白的问题，带着培养基，最后不会影响观察吗？
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7楼2015-11-22 10:09:28
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草溪河

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by vivi3168 at 2015-11-22 10:09:28
我们的扫描电镜是学校的，而且学校老师不管样品前处理，拿过去的就是要干燥好的。。。。对了，还有一个小白的问题，带着培养基，最后不会影响观察吗？...

不会的，相反没有附着在培养基，菌丝等的形态就变了。

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8楼2015-11-22 11:28:44
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vivi3168

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 草溪河 at 2015-11-22 11:28:44
不会的，相反没有附着在培养基，菌丝等的形态就变了。
...

好的，谢谢您了~那就我放心地做做试试了~
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9楼2015-11-22 12:24:56
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