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15853830932

木虫 (小有名气)

[交流] 酶切切不开 已有3人参与

各位大神,我用加酶切位点(HindIII和SspI)的引物PCR出来单一片段,然后做TA连接,但是提质粒做验证的时候,SspI能切开,HindIII酶切不开。试了两次了,还是不行,也过夜切了,不行。求助啊怎么回事。。。

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shx0743

新虫 (正式写手)


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两个酶的盐离子浓度要求一致么?

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2楼2015-11-18 09:13:50
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15853830932

木虫 (小有名气)

嗯,我用的Thermo的fastdigest酶,两个酶的buf都是一样的。刚看了一下测序图,感觉好像是PCR出问题了。没有P出酶切位点。。。。不知道怎么回事

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3楼2015-11-18 14:02:53
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疯子J-F

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你检查一下引物有没有加强酶切位点,然后重新PCR

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4楼2015-11-18 14:47:29
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cry_2013

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
1、检查一下引物上的酶切位点的碱基对不对(我有师妹引物加酶切位点时就加错了碱基,一直做不出,改了以后就顺利多了)
2、看看公用Buffer对不对,酶切效率怎么样(我感觉Buffer选对了,酶切位点也没问题都能切开,要不就是你的酶失活了)
5楼2015-11-20 16:21:24
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