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shoes

铜虫 (初入文坛)

[交流] 求助:PCR产物电泳时条带为什么被“劈开”了?

向各位老师请教:PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳的结果如图一。电泳条件:100mV,30min
最右端为marker,大小分别是100,200,…600kb
预期的PCR产物条带大小是480kb,不知道为什么出现了两条很接近的条带,个人感觉不像是引物二聚体。
奇怪的是酶切以后再电泳这种现象又消失了,条带清晰而完整。如图二
请各位老师帮忙分析分析原因,谢谢!
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christopher

金虫 (小有名气)

原因可能是制胶过程中出现问题,或是由于凝胶混合不均,或是配制过程导致底部和上层浓度不一致,所以电泳速度就不一样
同甘共苦,肝胆相照
2楼2008-09-16 01:18:51
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shoes

铜虫 (初入文坛)

非常感谢christopher站友的意见!
不过PCR产物和酶切产物电泳用的是同一批胶,为什么后者没有发现这种现象呢?
另外我个人猜想这种情况下(表层和底层之间出现了密度梯度)条带是不是应该拉的比较长,而不是分为两条?
3楼2008-09-16 10:42:24
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铜虫 (初入文坛)

有个师姐说可能是部分扩增产物自身成环了,具体怎么回事还不大清楚,比如形成机制,能不能避免等等,准备再问问她。
有哪位战友能解释一下吗?非常感谢!
4楼2008-09-17 20:16:10
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libo0628

银虫 (小有名气)

非特异扩增,退火温度提高两度试试
5楼2008-09-17 21:51:32
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annwt

木虫 (正式写手)

如果是胶或者电泳槽有问题,marker也应该是双着的,从图可见marker很正常,应该是产物有问题,

PCR产物可以讲相当复杂,正常的产物有时仅仅是人们的希望,而电泳又仅仅是按大小将核算分开,所以问题多。

处理意见:就像计算机死机就从新装系统一样,条件容许就从新PCR,注意都用新的,包括引物都是从新稀释的。这样也许会有理想的结果。祝你成功!

[ Last edited by annwt on 2008-9-19 at 22:13 ]
6楼2008-09-18 07:46:40
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shoes

铜虫 (初入文坛)

感谢两位的宝贵建议!
以上结果已经重复了多次。尝试改变了一些条件比如电泳槽和电压,没有改善。目前仍在继续努力,也希望大家多多帮忙!
另外在一篇过去发表的文献上见到了同样的问题(同样位点的同样实验:单核苷酸多态性)。文献没给出答案……
7楼2008-09-18 22:34:05
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