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想飞的fish

新虫 (小有名气)

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[交流] 不老的传说---PacBio第三代测序应用新进展

自然界中存在着各种奇妙的生物，扁形虫(flatworm)就是其中一种，科学家发现，永生的秘密或许就藏在扁形虫身上。这些生活在湖泊和池塘的蠕虫具有一次又一次再生的非凡能力，相当于可以长生不老。
　　如果将一条扁形虫一刀两断，带着头的那一部分会再长出一条尾巴来，而带着尾巴的那一部分会再长出一个头来。如果把它切成20段，就变出20条虫，而且每条都是完全复制。英国诺丁汉大学的科学家培育了2万多条虫，它们都来自第一条虫，他们指出，它们的身体和器官没有出现衰老迹象。
   这些扁形动物获得永生的关键是端粒，这些微小的生物钟像帽子一样覆盖在染色体末端。对于其他生物，通常情况下，随着时间推移，端粒会越来越短，阻止细胞分裂、再生，致使最终衰老。但在这种扁形动物体内，端粒完好无损，从而使细胞无限分裂，阻止衰老。
这种对端粒的保护机制，使它们具备了再生能力，进一步了解这些蠕虫再生的原因将有助于科学家完成“圣杯”实验，实现不断再生心脏、肝脏或脑细胞的目标，同时，还将加快研发延缓老年疾病药物的进程。但就其分子机制展开的研究，遇到了很大困难。该物种基因组非常特殊，75%的基因组为简单重复序列和转座子，对它进行测序和组装充满了挑战，根本无法注释良好的基因组序列，无法开展现代遗传学和分子生物学方面研究，使其价值无法得到挖掘和发挥。就如传说中的克里特岛迷宫一样，看似简单，却是一个不可能完成的任务。
      PacBio第三代测序技术，就如最终解决迷宫难题的那个线团。在2015年9月21日《PNAS》杂志上发表了由美国冷泉港实验室、霍华德休斯医学院等单位共同开展的关于扁形虫基因组和转录组方面的研究成果，“Genome and transcriptome of the regeneration competent flatworm, Macrostomum lignano”。
作者提到，曾经试图用illumina 二代测序技术对其进行基因组测序和组装，但结果非常不尽人意，170*的覆盖度的数据量，组装出来的contig N50却仅为222bp，完全拼不上呀，在二代测序尝试以失败告终之后，作者采用了最先进的以长读长著称的PacBio第三代单分子实时测序技术，通过130*的覆盖度，组装得到的contig N50达到了惊人的64kb，与二代测序组装结果相比，足足提升了近300倍。
      以此基因组为基础，研究者后续从转录组层面进行基因注释，并比较了扁形虫与哺乳动物干细胞发育相关的重要转录因子的差异，取得了极为丰富的信息量。
这种极端复杂基因组测序的成功，在业界引起了轩然大波，GenomeWeb当天就对该文进行了第一时间的报道，在报道中，报道者也对Pacbio 长读长单分子测序技术对复杂基因组测序能力给予了高度评价。
      从PacBio测序结果中挖掘的信息量巨大，无论是高GC含量区，简单重复片段，大片段重复区域，转录组分析，miRNA等等，都远超过illumina测序覆盖的范围，完胜二代测序结果。
      面对如此强大的研究工具，您还等待什么？天津生物芯片带您一起来了解Pacbio 测序仪的神秘而伟大：
   PacBio RS II 测序系统是太平洋生物技术公司（Pacific Biosciences）于2013年4月发布的，是目前唯一大规模商业化运行的第三代平台。该系统基于单分子实时（SMRT）测序技术，可以在一天内完成从样品制备到测序和读取序列的全过程。
PacBio RS II 测序系统优势
采用PacBio RS 平台，进行单分子实时测序（single molecule, real-time SMRT）主要技术优势有：
1、超长的测序读长：平均测序读长能达到10-14k，最长的序列能达到40k；
2、极端的准确率：对基因组组装和基因组变异检测，可以最多达到99.999%的准确率；选用特殊测序模式，测序准确率可以在达到单个分子99%准确率的条件下，读长超过经典的Sanger测序法；
3、极度的敏感性：可以检测频率在0.1%的 minor variants；
4、直接检测广泛的碱基修饰：除了5-methylcytosine修饰以外，还可以检测N6-methyladenine, N4-methylcytosine, DNA氧化损伤以及其它碱基的修饰.
5、最小的GC偏向性（GC bias）：在极端高GC和极端低GC区域，可以轻松测定，从而保证序列的均匀覆盖度；
6、无PCR扩增偏向性：样本不需要进行PCR扩增，避免了覆盖度不均一和PCR artifacts.
PacBio RS II 测序系统应用领域
1,De novo序列组装
   由于具有读长超长和无GC偏向性等特点，Pacbio RS II测序平台有效地降低了组装厚的Contig数，明显提高了基因组参考序列的质量。
某二倍体植物基因组大小为350Mb左右，且杂合度比较高。天津生物芯片使用P6-C4试剂组合，进行上机测序，测其全基因组DNA。最终测得subreads的总数据量为30.4Gb，经过过滤的subreads长度的N50值为15，450bp，subreads的平均长度为11，054bp。采用TBC研发的拼接策略仅用PacBio进行denovo拼接，最终获得了321Mb基因组序列，最终拼接结果的Contig N50值达到1.35Mb。
2，宏基因组测序
      环境微生物群落多样性分析，一般是基于Roche 454，miSEQ 等第二代高通量测序平台，对微生物核糖体16S rDNA 高变区域序列的某一（或者某几）区域进行测序。由于NGS 测序读长较短，测序长度无法覆盖整个16S 全长。而Pacbio 由于序列读长长，可完整覆盖( 1500bp) 16S 全长区域，所以在后期的分析中可以将微生物群落分类到种（species）。通过生物信息学分析揭示环境样品中众多不同类型微生物种类以及它们之间的相对丰度和进化关系。宏基因组对于分析探讨微生物多样性，研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源利用有着重要的理论和现实意义。
3全长转录本 Iso-Seq测序
      基于PacBio SMRT单分子实时测序技术的全长转录组测序无须打断RNA片段，使用RACE技术反转录得到的全长cDNA。该平台的超长读取（median 10kb）包含了单条完整转录本序列信息，后期分析无需组装，所测即所得。其测序结果可直接用于后续的Isoform、同源基因、基因家族、等位基因、可变剪接、lncRNA等分析。引导人们更深层次的理解位于中心法则中心地位的这一生命活动，另外还可用于对所在基因组的注释升级，完善基因组数据库。
   2013年10月的Nature biotechnology上斯坦福大学的Sharon等用PacBio对人的20个不同组织样本未打断的转录组进行了测序，通过比较分析，发现CCS reads大部分为全长转录本序列，且无论是长度还是reads质量以及转录本完整性等方面都要远远优于454测序结果。共鉴定出了约14000个spliced GENCODE genes，超过10%的部分有新的结构，而比对到未注释区域的转录本有相当一部分具有lncRNA的特征。结果有力的证明了PacBio对复杂真核生物进行全长RNA分子深度测序的可行性。

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