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蛋白质纯化亲和层析分离技术
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每一种新思想形成的背后都在积极面对“死胡同”时失落； 每一种新方法的产生也在处处留心每跨一步留下的脚印； 就像不积跬步无以至千里，不积小流无以成江海，一点一点的走心劳动，时间会在某个点积累汇聚，来到你想要的时刻。 这篇文章的主角是蛋白纯化亲和层析技术，在此概述了蛋白纯化亲和吸附层析的原理、应用等，该技术同样经过多年的慢慢演变过程，中间经历了前人的经验和智慧，才发展形成现在的一种新技术， 1910年时，淀粉吸附淀粉水解酶；1951年，免疫吸附剂能够分离抗体；1967年，胰蛋白酶的不容酶提纯胰蛋白酶抑制剂。 所以，给予你的实验，包括时间、经历、探索、思维、心态，慢慢磨练，等待想要的实验结果。 ——致终在实验台边奋斗的你 蛋白质亲和层析技术的原理 蛋白质亲和层析技术适应于理化性质差异性较小而难分离的蛋白质，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，其他的蛋白质对配体不具有特异性的结合能力，将通过柱子洗脱下来，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH值或者选择更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析住。它通常只需要一步操作便能将目的蛋白从混合物中分离出来，并且纯度很高。 蛋白纯化亲和层析的固相载体具有稳定的理化学性质，是一种含有较多化学反应基团的羟基多糖类介质，具有机械强度高，透性好，不溶于水，非特异性吸附少，多孔网状结构的特点。常用的载体有琼脂糖凝胶，其他的载体如葡聚糖凝胶，多孔硅胶，树脂，纤维素等，固相载体首先与特定的配体共价偶联形成具有化学活性的基团，即载体的活化，常见的有溴化氰活化载体，即将含有氨基偶联到载体的多糖基上，以及环氧氯丙烷在碱性条件下活化载体，其他的载体的活化剂还有戊二醛等。配体指被特异性蛋白质大分子所识别，并与蛋白质发生亲和作用的基团，如酶的作用底物，辅酶，激素受体，抗原与抗体的结合等； 蛋白质与层析载体上的配体通过共价键、范德华力、疏水力、静电力等作用发生生物学专一性结合形成复合物，共价链接在载体表面的功能团配体上。蛋白质亲和层析技术通过目标蛋白质与配体间通过特异性亲和力吸附而达到分离纯化的目的，具有生物专一性的特点，纯化效率高。 蛋白质亲和层析的应用分类： 抗原抗体的免疫亲和层析 利用抗原与抗体之间的特异性亲和力而进行分离的方法。所需的蛋白质作为抗原，经过动物免疫后形成抗体，抗体与活化的载体上的配基结合形成具有亲和力的吸附剂，利用目标蛋白与载体上的抗体特异性结合而达到分离纯化蛋白的目的。 生物素和亲和素 生物素和亲和素之间具有很强的特异性的亲和力。亲和素作为配体固定在载体上，将生物大分子用生物素标记，通过亲和素特异性吸附标记的生物大分子而纯化分离目标物质。例如，生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼脂糖结合，胰岛素被固定在琼脂糖柱子上而得到分离。 激素与受体蛋白 激素与受体蛋白具有高的亲和力，因此亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。受体蛋白如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素等，都可以利用激素与受体蛋白的特异性结合而分离； 凝集素与糖蛋白 带有糖基化的蛋白可用于含有外源凝集素的亲和柱进行分离，用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。 辅酶 利用辅酶对多种酶的亲和力可以对多种酶进行分离纯化。常用的辅酶有核苷酸及其衍生物，比如腺嘌呤核苷酸辅酶，AMP、ADP、ATP等，以及各种维生素，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。 氨基酸表面疏水性 固定化氨基酸作为配体，利用氨基酸间的疏水性质或者互补蛋白间的亲和力，可以分离纯化多种蛋白。 共价结合吸附 主要利用重组标签蛋白质与金属吸附柱之间通过共价结合吸附而分离纯化标签蛋白质。如GST（谷胱甘肽S转移酶）标签融合蛋白纯化以及His（组氨酸）标签融合蛋白纯化。将谷胱甘肽S转移酶与重组蛋白或者多肽链融合， GST标签融合蛋白通过谷胱甘肽S转移酶与固相载体上的谷胱甘肽之间通过酶与底物之间的共价特异性结合，从而达到和其他蛋白分离的目的。 金属螯合吸附 常用于分离对重金属有较强亲和力的蛋白。金属螯合通常使用亚胺二乙酸（IDA）螯合剂，它与Cu2+、Fe2+作用，形成带有多个配位基的螯合物，固定在载体上，作为配体吸附对重金属有特异结合能力的蛋白。例如利用基因工程构建带标签的蛋白His（组氨酸）标签融合蛋白，该蛋白对Ni2+等金属离子有高选择的特异性，因此，Ni2+等金属离子能够螯合His标签蛋白并吸附在固相载体上，而其他的蛋白质不能结合或者仅能微弱的结合，从而能够分离纯化目标蛋白。 多核苷酸和核酸配体 Poly-A配体能够结合各种RNA、RNA聚合酶以及其他的poly-A结合蛋白。 poly-U作为配体用于分离mRNA、以及各种poly-U结合蛋白。DNA作为配体，能够特异性结合各种DNA结合蛋白、DNA聚合酶等多种酶类。 小火柴的光芒： 科学的灵感，决不是坐等可以等来的。如果说，科学上的发现有什么偶然的机遇的话，那么这种“偶然的机遇”只能给那些学有素养的人，给那些善于独立思考的人，给那些具有锲而不舍的精神的人，而不会给懒汉。 ——华罗庚 规律总产生于问题之后，问题或许是一种困难，但也是一种机遇，所以，有点追求的你，也该为了拥抱大海坚持一下。 |
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2015-11-16 09:51:45, 93.83 K
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