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多糖HPLC衍生后结果。。。已有2人参与
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各位同僚~~多糖结构纠结死了。做的柱前衍生，PMP法。结果出来就这样了。。。。响应值好低，我这是过完SephadexG75后的纯化样品，蛋白含量很低。没想到就这样了，衍生的时候做了三个平行。另外附一张标准品阿拉伯糖的液相图，一样的衍生方法。大家能不能给分析一下。。。 H1.png  H2.png  H3.png  Arab.png |
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qingxiayuan
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【答案】应助回帖
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sty5959596(sytucom代发): 金币+2, 回帖精彩，谢谢参与 2015-11-18 22:35:46
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1.不知道你的阿拉伯糖标准品是不是被污染了，我们也有过被污染的情况，出来两个峰 2.基线有没有跑平，或者流动相有没有被污染了 3.不清楚你的衍生方法及液相条件，PMP衍生我做过5次了，每次都成功，一般来说标品峰都很高，样品峰比较低。 另外附我的衍生方法： 5 mg多糖样品，用蒸馏水配成5 mg/mL，取100 µL加入到具塞小管中,加入4 mol/L三氟乙酸(TFA) 100 µL并充氮气封管，120 ℃水解2 h。然后向冷却水解液中加入甲醇约200 µL，50 ℃旋转蒸发至干，如此重复3次，蒸干后向其中加100µL蒸馏水作衍生化反应使用。 100 µL酸水解后样品加入100 µL O.6M NaOH。混匀、然后取上述混合液100 µL,并向其中添加100 µL 0.5 M PMP甲醇溶液,漩涡混匀后,将混合物加热到70 ℃,反应lOO min,冷却至室温后,再用50 µL的0.3 M HCl中和反应液。反应混合物在50℃下旋转蒸发至干,向其中加入1 mL蒸馏水和1 mL氯仿,混匀后,小心吸取水相，弃氯仿层,萃取过程重复3次以除去PMP,抽提后的水相反应液用0.45 µm滤膜过滤后HPLC检测。 HPLC检测。条件如下:检测柱,RP-C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 µm Venusil, USA)；柱温,30℃；流动相,0.1 M PBS (pH 6.7)和乙腈比例(v/v)为 83:17；流速，l.O mL/min；检测波长,245 nm。 |
2楼2015-11-16 11:38:23
w911227
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6楼2015-11-16 16:51:18
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你阿拉伯糖标准品浓度太大了。看你样品中单糖成分太多了，跑成这个样不应该啊，是样品处理的问题吧。前几个月我也做糖了，你可以看我的主页下面我发的帖子，效果还可以。提醒你下样品中阿拉伯糖和木糖用液相是分不开的，如果有木糖就不能定量。 发自小木虫Android客户端 |
7楼2015-11-17 00:53:14
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我这是头一次做衍生，标品浓度是大了点，是10mg/ml，下次得稀释十倍了。样品的话，可能是我的水解有问题吧…或者是PMP没除掉…根据文献得知，我的样品里面，应该就只有一种糖…不应该这么多杂峰的…我也没想到出来这么多杂峰…不知道该怎么解决，求指教？ 发自小木虫IOS客户端 |
8楼2015-11-17 07:09:09
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多谢回复，我们实验室做糖的就只有两个人，没有师兄师姐。所以基本我的实验都是自己看文献摸索出来的。PMP衍生我做了两次了，头一次用的TSKgel Sugar AXG的柱子，没跑出来。这是第二次，用的C18柱，出峰了，但是不好看。 附上我的衍生方法，大神给看下： 纯化多糖配成3-4mg/ml糖液，取100微升糖液加100微升4M TFA，100℃下水解4小时，水解后冷却至室温，再加入200微升甲醇，混匀后氮气吹干，重复三次。干燥后的水解样品溶于100微升蒸馏水中，待衍生。 衍生：100微升水解样品加入100微升0.6M NaOH溶液，混合后取50微升混合液再加入50微升 0.5M 的PMP甲醇溶液，混匀。70℃下温浴100分钟，取出后冷却，加入50微升0.3M HCl中和。混合液吹干。再加入水和氯仿进行萃取，萃取三次，水相层过膜待上样。液相条件跟你的一样。。。。。 |
3楼2015-11-16 14:46:08
4楼2015-11-16 14:53:17
qingxiayuan
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5楼2015-11-16 15:05:57
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看你的样品峰，标准品浓度我觉得200ug/ml足够。怎么看你标准品里都有杂峰？再自己做个三五次原因都能找出来。流动相是什么，出峰时间有点长啊。 发自小木虫Android客户端 |
9楼2015-11-17 12:58:14
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流动相是磷酸盐缓冲液pH6.7，和乙腈…83比17的比例。我之前有看到过一篇文献上有人用pH10的缓冲液，可是我的c18柱最大承受就是10，所以我没敢用10的缓冲液 发自小木虫IOS客户端 |
10楼2015-11-17 13:02:00