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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 食品 » 碳水化合物 » 多糖HPLC衍生后结果。。。
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sty5959596

新虫 (初入文坛)

[求助] 多糖HPLC衍生后结果。。。已有2人参与

各位同僚~~多糖结构纠结死了。做的柱前衍生，PMP法。结果出来就这样了。。。。响应值好低，我这是过完SephadexG75后的纯化样品，蛋白含量很低。没想到就这样了，衍生的时候做了三个平行。另外附一张标准品阿拉伯糖的液相图，一样的衍生方法。大家能不能给分析一下。。。

多糖HPLC衍生后结果。。。
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多糖HPLC衍生后结果。。。-1
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多糖HPLC衍生后结果。。。-2
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多糖HPLC衍生后结果。。。-3
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1楼2015-11-16 09:51:21
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qingxiayuan

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 千凌VV at 2015-12-04 08:50:21
我也不太清楚三氯甲烷萃取的是什么？流动相A15%Y乙腈磷酸盐溶液B40%乙腈磷酸盐溶液，柱子就是C18柱，而且我中间没有涡旋，对衍生反应是不是有影响啊？

流动相比例
...

氯仿萃取的是PMP，我都是涡旋后才反应的。流动相和你的也不一样，不用在线混合乙腈吧，这样很容易有气泡啊。
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16楼2015-12-04 11:01:09
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qingxiayuan

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sty5959596(sytucom代发): 金币+2, 回帖精彩，谢谢参与 2015-11-18 22:35:46
1.不知道你的阿拉伯糖标准品是不是被污染了，我们也有过被污染的情况，出来两个峰
2.基线有没有跑平，或者流动相有没有被污染了
3.不清楚你的衍生方法及液相条件，PMP衍生我做过5次了，每次都成功，一般来说标品峰都很高，样品峰比较低。
另外附我的衍生方法：
5 mg多糖样品，用蒸馏水配成5 mg/mL，取100 µL加入到具塞小管中,加入4 mol/L三氟乙酸(TFA) 100 µL并充氮气封管，120 ℃水解2 h。然后向冷却水解液中加入甲醇约200 µL，50 ℃旋转蒸发至干，如此重复3次，蒸干后向其中加100µL蒸馏水作衍生化反应使用。
100 µL酸水解后样品加入100 µL O.6M NaOH。混匀、然后取上述混合液100 µL,并向其中添加100 µL 0.5 M PMP甲醇溶液,漩涡混匀后,将混合物加热到70 ℃,反应lOO min,冷却至室温后,再用50 µL的0.3 M HCl中和反应液。反应混合物在50℃下旋转蒸发至干,向其中加入1 mL蒸馏水和1 mL氯仿,混匀后,小心吸取水相，弃氯仿层,萃取过程重复3次以除去PMP,抽提后的水相反应液用0.45 µm滤膜过滤后HPLC检测。
HPLC检测。条件如下:检测柱,RP-C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 µm Venusil, USA)；柱温,30℃；流动相,0.1 M PBS (pH 6.7)和乙腈比例(v/v)为 83:17；流速，l.O mL/min；检测波长,245 nm。
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2楼2015-11-16 11:38:23
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sty5959596

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by qingxiayuan at 2015-11-16 11:38:23
1.不知道你的阿拉伯糖标准品是不是被污染了，我们也有过被污染的情况，出来两个峰
2.基线有没有跑平，或者流动相有没有被污染了
3.不清楚你的衍生方法及液相条件，PMP衍生我做过5次了，每次都成功，一般来说标品峰 ...

多谢回复，我们实验室做糖的就只有两个人，没有师兄师姐。所以基本我的实验都是自己看文献摸索出来的。PMP衍生我做了两次了，头一次用的TSKgel Sugar AXG的柱子，没跑出来。这是第二次，用的C18柱，出峰了，但是不好看。

附上我的衍生方法，大神给看下：
纯化多糖配成3-4mg/ml糖液，取100微升糖液加100微升4M TFA，100℃下水解4小时，水解后冷却至室温，再加入200微升甲醇，混匀后氮气吹干，重复三次。干燥后的水解样品溶于100微升蒸馏水中，待衍生。
衍生：100微升水解样品加入100微升0.6M NaOH溶液，混合后取50微升混合液再加入50微升 0.5M 的PMP甲醇溶液，混匀。70℃下温浴100分钟，取出后冷却，加入50微升0.3M  HCl中和。混合液吹干。再加入水和氯仿进行萃取，萃取三次，水相层过膜待上样。液相条件跟你的一样。。。。。
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3楼2015-11-16 14:46:08
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sty5959596

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by qingxiayuan at 2015-11-16 11:38:23
1.不知道你的阿拉伯糖标准品是不是被污染了，我们也有过被污染的情况，出来两个峰
2.基线有没有跑平，或者流动相有没有被污染了
3.不清楚你的衍生方法及液相条件，PMP衍生我做过5次了，每次都成功，一般来说标品峰 ...

你这里的120℃水解2小时，温度是如何控制的？我是用水浴锅，你是用的烘箱吗？我们实验室规定烘箱不能开着过夜。。。还有个问题，你后面说的50℃旋转蒸发，关键是体系很小啊，最小的蒸发瓶不是50ml的吗？
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4楼2015-11-16 14:53:17
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