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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR无法扩增出产物
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zyjwl2004

木虫 (正式写手)

[交流] PCR无法扩增出产物

如题，我扩了很多次，也尝试了很多条件，都扩不出来，不知道是那里出问题了。引物应该是没有什么问题的，有上海生工合成的，电泳后有引物二聚体。模板DNA也没有什么问题，电泳时质粒有三条带。其他的dNTP和Tag酶是宝生的，问题就是怎么扩都扩不出来，急啊请教各位，我该怎么办?谢谢
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1楼 2008-09-13 09:20:20
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):thx
片段多长？一般聚合时间以1min/kb算
以质粒为模板，变性时间最好长一些，预变性最好能有94℃，10min
片段越长，GC比越大，预变性的时间也应该相应变长
目的片段的GC比大（65%甚至更高）的话，可以尝试用high GC buffer
或者自己手工加DMSO等增强剂
但DMSO浓度过高也可能会抑制Taq酶的作用，所以自己要摸个梯度
另外，如果用高保真酶，效率会比普通重组Taq酶低，应该延长聚合时间

由于你提供的信息量比较少，所以只能给这么多建议
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2楼2008-09-13 09:43:25
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yylee

铁虫 (初入文坛)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):thx
实在不行就要考虑下引物的问题，换个公司合成一次引物看看，生工的引物... ...
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3楼2008-09-13 10:27:54
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lifei-fei

金虫 (著名写手)

伊丽莎白
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):thx
恩！模板浓度太大，也扩增不出！
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做有意义的事就是好好活着！
4楼2008-09-13 13:05:47
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victorhan

木虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):thx
阳性对照有没有条带啊,PCR实验有时候很怪,每次均需设置阳性\阴性\空白对照方可进一步分析
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有梦谁都了不起,有勇气就会有奇迹!
5楼2008-09-13 14:21:54
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greenspringmi

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):thx
做PCR时可以做的有：退火温度梯度、模板浓度梯度、引物浓度梯度；
这三种因素对结果的影响依次减低；
如果还是扩增不出来，建议重新设计引物。
你的PCR检测有引物二聚体，估计是引物本身的原因。
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6楼2008-09-13 22:19:42
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足下客

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
我跟楼主碰到过相同的问题，但不知楼主所要扩的基因片段是多大的？
我扩一个2.8KB的片段，花了我一个多月的时间才摸清条件。
如果片段长度大，建议你使用LA taq酶 和2*GC buffer I 或2*GC buffer II，首选第一种buffer。如果片段长度不大，可以试一下2*taq mix
可能你的退火温度选的也不合适，请问你的GC百分比是多少？

PS：我用的引物都是Invitrogen合成的，从来没出过问题  出现引物二聚体是很正常的，可以用Primer5给你的引物打一下分，一般要在五十分以上才能比较容易地扩出

[ Last edited by 足下客 on 2008-9-14 at 13:21 ]
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7楼2008-09-14 13:18:04
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zyjwl2004

木虫 (正式写手)
谢谢各位的恶意见了，我再摸下情况试下，再次谢谢
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8楼2008-09-15 10:16:54
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shuhua759

捐助贵宾 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
换同一个公司的引物，酶，DNTPS,BUFFER试试，我还遇到过不同的公司的试剂混用就P不出来的情况
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9楼2008-09-16 12:22:04
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吟啸徐行

银虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
DNA为模板扩增挺不好扩的，给你几个建议：1、稍微增加模板量 2、做个梯度PCR摸索合适的退火温度 3、延伸的温度要把握好 4、增加循环数
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10楼2008-09-16 18:08:58
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