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zyjwl2004

木虫 (正式写手)

[交流] PCR无法扩增出产物

如题,我扩了很多次,也尝试了很多条件,都扩不出来,不知道是那里出问题了。引物应该是没有什么问题的,有上海生工合成的,电泳后有引物二聚体。模板DNA也没有什么问题,电泳时质粒有三条带。其他的dNTP和Tag酶是宝生的,问题就是怎么扩都扩不出来,急啊请教各位,我该怎么办?谢谢
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dogdiemore

想当年我P了一年才P出来,帮同学P了一次就成功了,人生啊
11楼2008-09-16 20:10:35
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):thx
片段多长?一般聚合时间以1min/kb算
以质粒为模板,变性时间最好长一些,预变性最好能有94℃,10min
片段越长,GC比越大,预变性的时间也应该相应变长
目的片段的GC比大(65%甚至更高)的话,可以尝试用high GC buffer
或者自己手工加DMSO等增强剂
但DMSO浓度过高也可能会抑制Taq酶的作用,所以自己要摸个梯度
另外,如果用高保真酶,效率会比普通重组Taq酶低,应该延长聚合时间

由于你提供的信息量比较少,所以只能给这么多建议
2楼2008-09-13 09:43:25
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yylee

铁虫 (初入文坛)


reasonspare(金币+1,VIP+0):thx
实在不行就要考虑下引物的问题,换个公司合成一次引物看看,生工的引物... ...
3楼2008-09-13 10:27:54
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lifei-fei

金虫 (著名写手)

伊丽莎白


reasonspare(金币+1,VIP+0):thx
恩!模板浓度太大,也扩增不出!
做有意义的事就是好好活着!
4楼2008-09-13 13:05:47
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