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双酶切鉴定，为什么找不到所需要的目的条带？
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请各位实验大神救小弟于水深火热之中。。。 我现在的课题是做RNA干扰方面的实验，从网上设计的siRNA，然后根据文献设计了65bp长度的shRNA，前后分别加了HindIII和BamHI的酶切位点，所用的质粒是psilencer2.1-U6，我需要把这个65bp的片段插入质粒中，但是由于shRNA特有的发卡结构，不能通过常规大测序来判断是否成功插入了目的片段，所以只能通过双酶切鉴定来大体看一下。但是问题就出在这，我做了好几次，质粒也重新提取重新酶切连接了好几次，但是总是看不到65bp大小大条带，只能看到质粒的条带。附上图： 所用的酶是NEB的 HindIII-HF 和 BamHI-HF，根据说明书两酶可以一起37℃酶切15分钟即可（我也试过更长时间酶切）； 所用的胶是2%的，marker是20bp的ladder，100V跑30分钟左右（有人告诉我可能目的片段太小跑出胶去了，我也试过90V跑20分钟，但始终看不到65bp的条带）。 求各位同仁老师或者师兄师姐帮助啊，我的步骤哪里出了问题？有没有其他方法鉴定目的片段是否插入了？万分感谢！  11002.jpg  2014053079.jpg |
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