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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 双酶切鉴定，为什么找不到所需要的目的条带？
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mcxiaomu1023

铁虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切鉴定，为什么找不到所需要的目的条带？

请各位实验大神救小弟于水深火热之中。。。
   
    我现在的课题是做RNA干扰方面的实验，从网上设计的siRNA，然后根据文献设计了65bp长度的shRNA，前后分别加了HindIII和BamHI的酶切位点，所用的质粒是psilencer2.1-U6，我需要把这个65bp的片段插入质粒中，但是由于shRNA特有的发卡结构，不能通过常规大测序来判断是否成功插入了目的片段，所以只能通过双酶切鉴定来大体看一下。但是问题就出在这，我做了好几次，质粒也重新提取重新酶切连接了好几次，但是总是看不到65bp大小大条带，只能看到质粒的条带。附上图：

    所用的酶是NEB的 HindIII-HF 和 BamHI-HF，根据说明书两酶可以一起37℃酶切15分钟即可（我也试过更长时间酶切）；
   
    所用的胶是2%的，marker是20bp的ladder，100V跑30分钟左右（有人告诉我可能目的片段太小跑出胶去了，我也试过90V跑20分钟，但始终看不到65bp的条带）。

    求各位同仁老师或者师兄师姐帮助啊，我的步骤哪里出了问题？有没有其他方法鉴定目的片段是否插入了？万分感谢！
双酶切鉴定，为什么找不到所需要的目的条带？
11002.jpg


双酶切鉴定，为什么找不到所需要的目的条带？-1
2014053079.jpg
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1楼 2015-11-06 19:14:46
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ufo007ahh

铜虫 (初入文坛)
是不是酶保存不当失效了？

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2楼2015-11-06 22:27:25
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骆驼人

金虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-21 22:31:13
片段太小了，发卡结构也是可以测序的，测序的时候告诉他们存在特殊发卡结构，之前我做的一个发卡结构测序完全正确，去测序吧

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愿你，温柔又坚定，不轻易许诺但许的诺一定会实现，有勇气有力量，会发现一切美好的事物
3楼2015-11-06 22:31:59
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嗜血的猫咪

金虫 (小有名气)
多少体系，体系小的话可以适当增大体系
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4楼2015-11-08 18:04:24
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mcxiaomu1023

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ufo007ahh at 2015-11-06 22:27:25
是不是酶保存不当失效了？

谢谢您的提醒，昨天鉴定了下酶的活性，两种内切酶的活性都还挺好
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5楼2015-11-09 08:01:22
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mcxiaomu1023

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 嗜血的猫咪 at 2015-11-08 18:04:24
多少体系，体系小的话可以适当增大体系

谢谢您的建议，我做酶切鉴定的时候都是用的10ul 体系，您提醒之后感觉确实有这方面的问题，10ul体系跑胶载体的条带很清楚，目的片段可能就不会那么清晰了
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6楼2015-11-09 08:03:49
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mcxiaomu1023

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 骆驼人 at 2015-11-06 22:31:59
片段太小了，发卡结构也是可以测序的，测序的时候告诉他们存在特殊发卡结构，之前我做的一个发卡结构测序完全正确，去测序吧

嗯，谢谢您的回复，我打算换一家测序公司试试
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7楼2015-11-09 08:04:55
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轩辕漪

禁虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-02-21 22:31:39
本帖内容被屏蔽
8楼2016-02-21 14:41:38
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-21 22:31:57
本帖仅楼主可见
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9楼2016-02-21 18:03:13
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