| 查看: 2983 | 回复: 8 | ||
[求助]
双酶切鉴定，为什么找不到所需要的目的条带？
|
|
请各位实验大神救小弟于水深火热之中。。。 我现在的课题是做RNA干扰方面的实验，从网上设计的siRNA，然后根据文献设计了65bp长度的shRNA，前后分别加了HindIII和BamHI的酶切位点，所用的质粒是psilencer2.1-U6，我需要把这个65bp的片段插入质粒中，但是由于shRNA特有的发卡结构，不能通过常规大测序来判断是否成功插入了目的片段，所以只能通过双酶切鉴定来大体看一下。但是问题就出在这，我做了好几次，质粒也重新提取重新酶切连接了好几次，但是总是看不到65bp大小大条带，只能看到质粒的条带。附上图： 所用的酶是NEB的 HindIII-HF 和 BamHI-HF，根据说明书两酶可以一起37℃酶切15分钟即可（我也试过更长时间酶切）； 所用的胶是2%的，marker是20bp的ladder，100V跑30分钟左右（有人告诉我可能目的片段太小跑出胶去了，我也试过90V跑20分钟，但始终看不到65bp的条带）。 求各位同仁老师或者师兄师姐帮助啊，我的步骤哪里出了问题？有没有其他方法鉴定目的片段是否插入了？万分感谢！  11002.jpg  2014053079.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
科研人必读：新一代 KRAS G12C 抑制剂 Olomorasib 的研究进展
已经有0人回复
-
BT-11（Omilancor）研究化合物全解析：从分子结构到实验应用要点
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有267人回复
-
富马酸贝达喹啉：二芳基喹啉类工具化合物的化学特征
已经有0人回复
-
BT投稿with editor状态快两周了，正常吗
已经有25人回复
-
Silevertinib（BDTX-1535）结构拆解：炔基双环片段为何成为合成瓶颈
已经有0人回复
-
RO4929097 解析：双苯并氮杂䓬骨架与 Notch 通路实验设计要点
已经有0人回复
-
分子量 1157 的 PROTAC 怎么配不析出：SGK3-PROTAC1 的溶解、分装与图谱复核
已经有0人回复
-
logP 6.1 的羧酸怎么配母液：GSK 650394 的溶解窗口与稀释顺序
已经有0人回复
-
从"水不溶"到 71 mg/mL：雷特格韦的 pH 依赖溶解与螯合色谱边界
已经有0人回复
-
133 Ų 的极性表面积，如何决定 TNG462 的母液配制与色谱条件
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 【专题】基因克隆知识问答及FAQ
已经有0人回复
2楼2015-11-06 22:27:25
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-21 22:31:13
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-21 22:31:13
|
片段太小了，发卡结构也是可以测序的，测序的时候告诉他们存在特殊发卡结构，之前我做的一个发卡结构测序完全正确，去测序吧 发自小木虫Android客户端 |
3楼2015-11-06 22:31:59
4楼2015-11-08 18:04:24
5楼2015-11-09 08:01:22
6楼2015-11-09 08:03:49
7楼2015-11-09 08:04:55
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-02-21 22:31:39
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-02-21 22:31:39
|
本帖内容被屏蔽 |
8楼2016-02-21 14:41:38
匿名
用户注销 (正式写手)
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 4476.8
- 散金: 33
- 红花: 4
- 帖子: 743
- 在线: 156.8小时
- 虫号: 0
- 注册: 2015-08-31
- 性别: GG
- 专业: 兽医传染病学
9楼2016-02-21 18:03:13
