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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 单酶切 后 连接 总连不上啊
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xuguang09280036

新虫 (初入文坛)

[交流] 单酶切 后 连接 总连不上啊

将片段和 载体 单酶切 后 连接     筛选的都是载体自连的   也做载体的 脱磷酸化了 啊  唉 愁啊    有何高见 啊 大家  都做了一个月了
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1楼 2008-09-09 22:45:43
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

呵呵

载体单酶切后,胶回收.
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2楼2008-09-09 23:24:48
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xuguang09280036

新虫 (初入文坛)
载体用 回收吗  直接抽提  乙醇沉淀 不久好了  反正就一个片段 ，  不过我的目的片段是从另一个载体上切下来的  是胶回收的
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3楼2008-09-09 23:53:41
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xipha

木虫 (正式写手)
脱磷酸化不足，建议改进。
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4楼2008-09-10 08:52:23
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lx830618

金虫 (正式写手)
可能是载体去磷酸化没有去干净，你可以做一个载体的对照看是不是自连很严重，如果是的话那你好好处理载体吧
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5楼2008-09-10 08:54:25
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shensc727

金虫 (小有名气)
★ ★
司马诸葛(金币+2,VIP+0):谢谢交流 7-13 05:41
1、通过空白对照，测试载体磷酸化的效率，如果不好，改进条件！我做过磷酸化，效果不是很好！
2、建议你用双酶切（不同的粘性末端内切酶），回收，然后连接，这样效率高！我不太清楚你的情况！难道你的试验只能做单酶切吗？
3、你的目的基因是PCR产物直接回收然后酶切吗？建议你先连T载体，然后酶切回收！
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6楼2008-09-10 09:15:56
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lufuhao

木虫 (著名写手)

极品木虫
载体片断与目的片段各有多大？两者如果相差很大，是不好连的！
我一般都不去磷酸化，难于连接的载体酶切后回收也不失为一种好方法。
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将心比心
7楼2008-09-10 10:30:02
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
载体和基因的比例不好吧，多加点基因，载体：基因摩尔的比达到1：15试试
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8楼2008-09-10 10:43:11
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
单酶切自连很正常 注意载体和片段的比例大概1：3就可以了 另外都要胶回收 并且你可以多挑克隆 做检测 总会有插入进去的
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9楼2008-09-10 11:25:52
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xuguang09280036

新虫 (初入文坛)
如果载体 的 去磷酸化 实在是不好的话 再怎么处理呢 ？ 我的片段4.3  k , 载体 12k
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10楼2008-09-10 22:34:34
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