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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 毕赤酵母表达脂肪酶基因
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wyfdgg

新虫 (初入文坛)

[交流] 毕赤酵母表达脂肪酶基因 已有2人参与

我是利用Ppic9k来转化毕赤酵母的，连入基因之后再用BglII酶切，然后电转毕赤酵母细胞。基因的长度在1000-2000之间。
转化后在RDB平板上面涂板，有很多个白色的单克隆。然后用YPD洗板在突细胞悬液到YPD遗传霉素平板上面，我用的遗传霉素浓度为1g/l、2g/l、3g/l、4g/l。但是即使是4g/l的平板上面长出来的单克隆，提取基因组DNA之后做PCR验证，大部分也不能批到目的条带。少数含有目的条带的菌株进行产酶培养的时候，几乎没有酶活。而且跑SDS-PAGE时，也看不到蛋白条带。
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1楼 2015-10-27 15:50:28
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wyfdgg

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jjwhl at 2015-11-04 16:13:01
没有酶活跟蛋白条带说明表达量低，需要提高表达量才行

我已经是从4g/l的平板上面挑选的了   应该基因插入数量很多了
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3楼2015-11-12 09:49:13
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jjwhl

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
没有酶活跟蛋白条带说明表达量低，需要提高表达量才行
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2楼2015-11-04 16:13:01
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justsangsue

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
表达效率和基因拷贝数没有必然联系，拷贝数多可以减少密度基因突变导致的目标蛋白异常。而且蛋白是否表达还是要以wb为准吧

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2015-11-27 09:37:37
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