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连接酶加入顺序对克隆的影响有多大？
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昨天，我做了一下平末端DNA克隆，用的是北京庄盟的零背景ZT4-Blunt快速克隆试剂盒，感受态细胞用的是改公司的EX-T1高效感受态细胞，可是转化后只有转化对照PUC19可见单克隆菌落，连接阳性对照以及我的样品均无菌落，不过培养基表面均可见模糊细菌点。考虑了可能有两个原因： 1、涂布菌液过浓，因为是复苏一小时后，离心1min 以约200 微升培养基重悬涂板的，离心后菌体均不少，请问各位是否有会有这样的结果呢？ 2、因为一次做了多个插入片段，所以先配制了混合母液（连接酶液加了），分装后最后才加的插入片段，所以郁闷是否由于这样所以载体自连了，因为该载体带致死基因，如果自连的话就不会形成菌落，是这个原因吗？ |
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