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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » western blot 检测磷酸化蛋白之后是否需要strip去除抗体再检测总蛋白？
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icid

银虫 (初入文坛)

[交流] western blot 检测磷酸化蛋白之后是否需要strip去除抗体再检测总蛋白？ 已有4人参与

许多文献会给出磷酸化蛋白的条带以及相应的总蛋白（磷酸化和未磷酸化蛋白）的条带，那么在检测完磷酸化蛋白之后是否一定要strip去除原来的一抗二抗之后才能检测相应的总蛋白？如果没有strip，那么检测到的总蛋白结果是否可靠？如果strip了，那么是否需要验证原来的一抗和二抗已经去除干净（即再次封闭后孵育二抗，然后再检测），而不只是加显影液检测二抗？另外，有些抗体没有标明可以同时检测磷酸化和未磷酸化的蛋白，那么这种抗体是否不合适？有人注意过这个问题吗？
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1楼 2015-09-24 21:18:38
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evangelina

无虫 (小有名气)
★
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一定要strip去除原来的一抗二抗之后才能检测相应的总蛋白

验证原来的一抗和二抗已经去除干净，再次封闭后孵育二抗，然后再检测是比较保守的做法。
特别是当磷酸化和总蛋白一抗是同源（例如都是小鼠）的时候

有些抗体没有标明可以同时检测磷酸化和未磷酸化的蛋白。。。去网上的产品datasheet看看，如果没有说清楚就谨慎用
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2楼2015-09-24 22:31:50
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heady_z

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
为嘛不同样蛋白跑两份，一张膜显磷酸化，一张膜显总蛋白，非要整那么麻烦
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3楼2015-09-25 15:26:38
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icid

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by evangelina at 2015-09-24 22:31:50
一定要strip去除原来的一抗二抗之后才能检测相应的总蛋白

验证原来的一抗和二抗已经去除干净，再次封闭后孵育二抗，然后再检测是比较保守的做法。
特别是当磷酸化和总蛋白一抗是同源（例如都是小鼠）的时候

...

谢谢，最近在进行相关实验。
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4楼2015-09-25 21:59:09
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icid

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by heady_z at 2015-09-25 15:26:38
为嘛不同样蛋白跑两份，一张膜显磷酸化，一张膜显总蛋白，非要整那么麻烦

这样可以被认可吗？
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5楼2015-09-25 21:59:43
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heady_z

金虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
5楼: Originally posted by icid at 2015-09-25 21:59:43
这样可以被认可吗？...

当然可以了，两种膜跑完全一样的蛋白
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6楼2015-09-26 09:00:49
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icid

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by heady_z at 2015-09-26 09:00:49
当然可以了，两种膜跑完全一样的蛋白...

学习了，谢谢
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7楼2015-09-26 10:09:50
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)
★
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本帖内容被屏蔽
8楼2015-09-26 10:52:42
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icid

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ghqiu09 at 2015-09-26 10:52:42
据说strip后膜背景会比较深。从来没strip过，磷酸化本来就不好显，我们一般洗洗第二天直接显，碰到强的蛋白就直接跑两份

背景倒是没有变深，我现在遇到的情况是磷酸化的一抗除不干净，导致最后测得总蛋白条带甚至比磷酸化的更弱许多。看来要考虑跑两份了。
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9楼2015-09-28 21:27:22
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火花火王

铜虫 (初入文坛)
什么叫strip？
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10楼2015-10-02 20:38:42
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