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icid

银虫 (初入文坛)

[交流] western blot 检测磷酸化蛋白之后是否需要strip去除抗体再检测总蛋白? 已有4人参与

许多文献会给出磷酸化蛋白的条带以及相应的总蛋白(磷酸化和未磷酸化蛋白)的条带,那么在检测完磷酸化蛋白之后是否一定要strip去除原来的一抗二抗之后才能检测相应的总蛋白?如果没有strip,那么检测到的总蛋白结果是否可靠?如果strip了,那么是否需要验证原来的一抗和二抗已经去除干净(即再次封闭后孵育二抗,然后再检测),而不只是加显影液检测二抗?另外,有些抗体没有标明可以同时检测磷酸化和未磷酸化的蛋白,那么这种抗体是否不合适?有人注意过这个问题吗?
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icid

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by ghqiu09 at 2015-09-26 10:52:42
据说strip后膜背景会比较深。从来没strip过,磷酸化本来就不好显,我们一般洗洗第二天直接显,碰到强的蛋白就直接跑两份

背景倒是没有变深,我现在遇到的情况是磷酸化的一抗除不干净,导致最后测得总蛋白条带甚至比磷酸化的更弱许多。看来要考虑跑两份了。
9楼2015-09-28 21:27:22
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evangelina

无虫 (小有名气)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
一定要strip去除原来的一抗二抗之后才能检测相应的总蛋白

验证原来的一抗和二抗已经去除干净,再次封闭后孵育二抗,然后再检测是比较保守的做法。
特别是当磷酸化和总蛋白一抗是同源(例如都是小鼠)的时候

有些抗体没有标明可以同时检测磷酸化和未磷酸化的蛋白。。。去网上的产品datasheet看看,如果没有说清楚就谨慎用
2楼2015-09-24 22:31:50
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heady_z

金虫 (小有名气)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
为嘛不同样蛋白跑两份,一张膜显磷酸化,一张膜显总蛋白,非要整那么麻烦
3楼2015-09-25 15:26:38
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icid

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by evangelina at 2015-09-24 22:31:50
一定要strip去除原来的一抗二抗之后才能检测相应的总蛋白

验证原来的一抗和二抗已经去除干净,再次封闭后孵育二抗,然后再检测是比较保守的做法。
特别是当磷酸化和总蛋白一抗是同源(例如都是小鼠)的时候

...

谢谢,最近在进行相关实验。
4楼2015-09-25 21:59:09
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