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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 聚丙烯酰胺凝胶电泳灌胶技巧
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杜仲谷

木虫 (职业作家)

金虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
19楼: Originally posted by slina0925 at 2015-09-29 09:59:20
请问，您在做变性胶的时候那个Marker用的是什么，在哪里买的，我联系好多家公司都没有卖专门做变性聚丙烯酰胺凝胶的Marker...

您好，我做变性胶的时候，也和您一样，对于Marker的选择特别留心了一下。发现，无论Takara还是生工，都没有针对我的PCR产物片段大小的专门做变性胶的marker。
而且，我试了Takara公司的琼脂糖电泳时常用的DL 500bp的marker应用于PAGE变性胶。
在8％变性胶电泳之前，先对marker也95℃变性了一下，然后进行了点样，发现，marker带型变了，跟说明书上的不一样了。我后来不对marker变性，仅仅对PCR产物变性，再进行8％变性PAGE胶电泳。发现marker的带型又对了。自那以后，只对PCR产物变性，marker不变性。

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从事分生的药学生
21楼2015-09-29 12:24:39
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杜仲谷

木虫 (职业作家)

金虫
不知道您做变性PAGE胶时，loading buffer是怎么配的？我自己配置了一份loading buffer，可能是因为放了4℃冰箱放了半年的原因，点样时，PCR产物沉不下去，总是容易从点样孔漂出来，即使我观察到，我做的非常细致，将样品加入了点样孔底部，刚开始样品似乎是沉到底部，但，不出2分钟，所有样品就全部漂上来了。
我把我的变性胶loading buffer配方列出来给您看看，希望您能帮忙解答下。
变性胶loading buffer配方:
去离子甲酰胺 49mL（最终浓度约98％）
0.5M的EDTA（pH8.0） 1mL（最终浓度为10mM）
溴酚蓝 0.125g（最终浓度约0.25％）
二甲苯青 0.125g（最终浓度约0.25％）。

注，我所有的试剂都是生工公司进口分装，新订购的产品。
聚丙烯酰胺凝胶电泳灌胶技巧


聚丙烯酰胺凝胶电泳灌胶技巧-1



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从事分生的药学生
22楼2015-09-29 12:40:30
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繁夏

版主 (知名作家)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

有气泡是你加太快了，你用注射器或者移液枪慢慢沿着壁(边壁)加进去，基本就不会有气泡！

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23楼2015-09-29 13:11:02
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yvonne9044

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lf8306887 at 2015-09-25 14:53:04
这方面哥是绝对的权威，这个胶是用来做变性胶的，用于SSR分子标记，这个哥哥以前做博士做了三年，每天8块胶，每个胶板单次上样64个左右，SSR标记较集中的引物，可以间隔15分钟进行二次上样，这样每一块胶能跑128个样 ...

哥哥呀，据说这东西算分析领域毒性比较强的，你做了这么多，活得还好么

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24楼2015-09-29 13:21:14
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自荐的毛遂

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我觉得你是不是不是垂直加的啊，只要是垂直加的应该不会出现气泡。我也是刚开始做
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认真去做好每一件你认为该做的事情
25楼2015-09-29 13:22:49
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自荐的毛遂

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
24楼: Originally posted by yvonne9044 at 2015-09-29 13:21:14
哥哥呀，据说这东西算分析领域毒性比较强的，你做了这么多，活得还好么
...

我觉得分子实验绝大部分都有毒，只能说为了科学现身
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认真去做好每一件你认为该做的事情
26楼2015-09-29 14:51:32
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yvonne9044

新虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 自荐的毛遂 at 2015-09-29 14:51:32
我觉得分子实验绝大部分都有毒，只能说为了科学现身...

你说的也有道理～我觉得跑水平板比垂直板好些～

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27楼2015-09-29 15:06:29
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slina0925

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 杜仲谷 at 2015-09-29 12:40:30
不知道您做变性PAGE胶时，loading buffer是怎么配的？我自己配置了一份loading buffer，可能是因为放了4℃冰箱放了半年的原因，点样时，PCR产物沉不下去，总是容易从点样孔漂出来，即使我观察到，我做的非常细致，将 ...

电泳缓冲液需要1乘的TBE，如果浓度高也会出现沉降不下去的现象，那个Loading Bffer 是在生工上买的，您可以直接电话咨询一下，是2乘的SSCP，您在详细咨询下吧，希望对您有帮助
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没有什么大不了的。。。
28楼2015-09-29 15:41:11
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杜仲谷

木虫 (职业作家)

金虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
28楼: Originally posted by slina0925 at 2015-09-29 15:41:11
电泳缓冲液需要1乘的TBE，如果浓度高也会出现沉降不下去的现象，那个Loading Bffer 是在生工上买的，您可以直接电话咨询一下，是2乘的SSCP，您在详细咨询下吧，希望对您有帮助...

非常感谢，您能将生工的Loading Buffer产品货号告诉我一下吗？或者拍个图发上来行吗？
我的电泳缓冲液是新配置的1 X TBE，pH约8.0。
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从事分生的药学生
29楼2015-09-29 19:13:40
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郭盼盼

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 杜仲谷 at 2015-09-29 12:40:30
不知道您做变性PAGE胶时，loading buffer是怎么配的？我自己配置了一份loading buffer，可能是因为放了4℃冰箱放了半年的原因，点样时，PCR产物沉不下去，总是容易从点样孔漂出来，即使我观察到，我做的非常细致，将 ...

我做的变性胶loading buffer 配方是甲酰胺95ml ， 10mmol 的EDTA（PH8.0) 2ml， 二甲苯氰0.09g，溴酚蓝0.09g，加水至100ml, 效果还不错，没有出现过一次你说的那样飘样的情况，你可以参考一下
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坚持该坚持的
30楼2015-09-30 09:35:21
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