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杜仲谷

木虫 (职业作家)

金虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
19楼: Originally posted by slina0925 at 2015-09-29 09:59:20
请问,您在做变性胶的时候那个Marker用的是什么,在哪里买的,我联系好多家公司都没有卖专门做变性聚丙烯酰胺凝胶的Marker...

您好,我做变性胶的时候,也和您一样,对于Marker的选择特别留心了一下。发现,无论Takara还是生工,都没有针对我的PCR产物片段大小的专门做变性胶的marker。
而且,我试了Takara公司的琼脂糖电泳时常用的DL 500bp的marker应用于PAGE变性胶。
在8%变性胶电泳之前,先对marker也95℃变性了一下,然后进行了点样,发现,marker带型变了,跟说明书上的不一样了。我后来不对marker变性,仅仅对PCR产物变性,再进行8%变性PAGE胶电泳。发现marker的带型又对了。自那以后,只对PCR产物变性,marker不变性。

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从事分生的药学生
21楼2015-09-29 12:24:39
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杜仲谷

木虫 (职业作家)

金虫

不知道您做变性PAGE胶时,loading buffer是怎么配的?我自己配置了一份loading buffer,可能是因为放了4℃冰箱放了半年的原因,点样时,PCR产物沉不下去,总是容易从点样孔漂出来,即使我观察到,我做的非常细致,将样品加入了点样孔底部,刚开始样品似乎是沉到底部,但,不出2分钟,所有样品就全部漂上来了。
我把我的变性胶loading buffer配方列出来给您看看,希望您能帮忙解答下。
变性胶loading buffer配方:
去离子甲酰胺 49mL(最终浓度约98%)
0.5M的EDTA(pH8.0) 1mL(最终浓度为10mM)
溴酚蓝 0.125g(最终浓度约0.25%)
二甲苯青 0.125g(最终浓度约0.25%)。

注,我所有的试剂都是生工公司进口分装,新订购的产品。
聚丙烯酰胺凝胶电泳灌胶技巧


聚丙烯酰胺凝胶电泳灌胶技巧-1



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从事分生的药学生
22楼2015-09-29 12:40:30
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繁夏

版主 (知名作家)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

有气泡是你加太快了,你用注射器或者移液枪慢慢沿着壁(边壁)加进去,基本就不会有气泡!

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23楼2015-09-29 13:11:02
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yvonne9044

新虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by lf8306887 at 2015-09-25 14:53:04
这方面哥是绝对的权威,这个胶是用来做变性胶的,用于SSR分子标记,这个哥哥以前做博士做了三年,每天8块胶,每个胶板单次上样64个左右,SSR标记较集中的引物,可以间隔15分钟进行二次上样,这样每一块胶能跑128个样 ...

哥哥呀,据说这东西算分析领域毒性比较强的,你做了这么多,活得还好么

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24楼2015-09-29 13:21:14
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自荐的毛遂

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我觉得你是不是不是垂直加的啊,只要是垂直加的应该不会出现气泡。我也是刚开始做
认真去做好每一件你认为该做的事情
25楼2015-09-29 13:22:49
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自荐的毛遂

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
24楼: Originally posted by yvonne9044 at 2015-09-29 13:21:14
哥哥呀,据说这东西算分析领域毒性比较强的,你做了这么多,活得还好么
...

我觉得分子实验绝大部分都有毒,只能说为了科学现身
认真去做好每一件你认为该做的事情
26楼2015-09-29 14:51:32
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yvonne9044

新虫 (正式写手)

引用回帖:
26楼: Originally posted by 自荐的毛遂 at 2015-09-29 14:51:32
我觉得分子实验绝大部分都有毒,只能说为了科学现身...

你说的也有道理~我觉得跑水平板比垂直板好些~

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27楼2015-09-29 15:06:29
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slina0925

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
22楼: Originally posted by 杜仲谷 at 2015-09-29 12:40:30
不知道您做变性PAGE胶时,loading buffer是怎么配的?我自己配置了一份loading buffer,可能是因为放了4℃冰箱放了半年的原因,点样时,PCR产物沉不下去,总是容易从点样孔漂出来,即使我观察到,我做的非常细致,将 ...

电泳缓冲液需要1乘的TBE,如果浓度高也会出现沉降不下去的现象,那个Loading Bffer 是在生工上买的,您可以直接电话咨询一下,是2乘的SSCP,您在详细咨询下吧,希望对您有帮助
没有什么大不了的。。。
28楼2015-09-29 15:41:11
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杜仲谷

木虫 (职业作家)

金虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
28楼: Originally posted by slina0925 at 2015-09-29 15:41:11
电泳缓冲液需要1乘的TBE,如果浓度高也会出现沉降不下去的现象,那个Loading Bffer 是在生工上买的,您可以直接电话咨询一下,是2乘的SSCP,您在详细咨询下吧,希望对您有帮助...

非常感谢,您能将生工的Loading Buffer产品货号告诉我一下吗?或者拍个图发上来行吗?
我的电泳缓冲液是新配置的1 X TBE,pH约8.0。
从事分生的药学生
29楼2015-09-29 19:13:40
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郭盼盼

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
22楼: Originally posted by 杜仲谷 at 2015-09-29 12:40:30
不知道您做变性PAGE胶时,loading buffer是怎么配的?我自己配置了一份loading buffer,可能是因为放了4℃冰箱放了半年的原因,点样时,PCR产物沉不下去,总是容易从点样孔漂出来,即使我观察到,我做的非常细致,将 ...

我做的变性胶loading buffer 配方是甲酰胺95ml , 10mmol 的EDTA(PH8.0) 2ml, 二甲苯氰0.09g,溴酚蓝0.09g,加水至100ml, 效果还不错,没有出现过一次你说的那样飘样的情况,你可以参考一下
坚持该坚持的
30楼2015-09-30 09:35:21
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