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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR退火温度的取舍
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shisishese

银虫 (小有名气)
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PCR退火温度的取舍
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请问一下，我做了退火温度梯度设定，最后如何根据结果选取最适合的那一个温度？有什么参照吗？
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1楼2015-09-20 16:24:08
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15853830932

木虫 (小有名气)
★
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Tm值左右，再看亮度

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10楼2015-09-20 17:30:52
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976592787

木虫 (正式写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-20 22:21:09
退火温度影响不是太大，你可以55度p试试行不，不行就换成58度p，一般p不出来是引物设计和聚合酶的问题，与退火温度关系不大

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3楼2015-09-20 16:27:32
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
拿primer blast算一下就行了

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5楼2015-09-20 16:52:56
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wx3280065

银虫 (小有名气)
看条带亮度

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15楼2015-09-21 07:08:21
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shisishese

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 15853830932 at 2015-09-20 17:30:52
Tm值左右，再看亮度

亮度怎样的合适呢？
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16楼2015-09-21 10:10:34
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shisishese

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-09-20 16:52:56
拿primer blast算一下就行了

算了，然后呢？
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Neo2000
17楼2015-09-21 10:11:08
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
17楼: Originally posted by shisishese at 2015-09-21 10:11:08
算了，然后呢？...

Tm就按算出来的整啊

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18楼2015-09-21 10:14:26
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shisishese

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-09-21 10:14:26
Tm就按算出来的整啊
...

因为没做过，不太明白你讲的是什么，能不吝赐教吗？
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19楼2015-09-21 10:19:07
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以试试啊，总不能手把手教你吧，primer blast有文献参考的

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20楼2015-09-21 10:20:31
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反应链

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你有没有梯度PCR的电泳图？那样可以描述地更有针对性一些。
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22楼2015-09-21 14:54:06
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Mis_Q

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们一般情况就是在Tm上下几度范围内设梯度，然后把PCR产物跑琼脂糖凝胶，挑选没有非特异性条带且目标条带最亮的温度。
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23楼2015-09-21 15:01:29
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15853830932

木虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by shisishese at 2015-09-21 10:10:34
亮度怎样的合适呢？...

看你的目的条带亮不亮，杂带一般不是很亮啊

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24楼2015-09-21 15:34:52
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jessicapsliu

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
首先建议你看一下梯度以后自己的目的条带是否清晰，再看杂带多不多，选择杂带最少，目的带最清晰的温度就可以
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25楼2015-09-21 15:40:44
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shisishese

银虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by Mis_Q at 2015-09-21 15:01:29
我们一般情况就是在Tm上下几度范围内设梯度，然后把PCR产物跑琼脂糖凝胶，挑选没有非特异性条带且目标条带最亮的温度。

谢谢
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26楼2015-09-21 20:29:54
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shisishese

银虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by jessicapsliu at 2015-09-21 15:40:44
首先建议你看一下梯度以后自己的目的条带是否清晰，再看杂带多不多，选择杂带最少，目的带最清晰的温度就可以

谢谢
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27楼2015-09-21 20:30:43
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shisishese

银虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 15853830932 at 2015-09-21 15:34:52
看你的目的条带亮不亮，杂带一般不是很亮啊
...

谢谢
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28楼2015-09-21 20:30:52
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a610291425

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我经常做一代测序，我所采用的方法是设温度梯度扩增后跑胶，选择条带清晰明亮，片段大小与你引物设计一致的，并且没有非特异和二聚体的，退火温度对扩增影响蛮大的哦
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29楼2015-09-22 10:49:12
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shisishese

银虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by a610291425 at 2015-09-22 10:49:12
我经常做一代测序，我所采用的方法是设温度梯度扩增后跑胶，选择条带清晰明亮，片段大小与你引物设计一致的，并且没有非特异和二聚体的，退火温度对扩增影响蛮大的哦

多谢啦
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30楼2015-09-22 20:19:26
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9765927872楼
2015-09-20 16:24   回复  
shisishese(金币+1): 谢谢参与
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Neo20004楼
2015-09-20 16:52   回复  
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MAYINGTAI6楼
2015-09-20 16:54   回复  
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neu2347楼
2015-09-20 16:57   回复  
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冷雁孤旅8楼
2015-09-20 17:29   回复  
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158538309329楼
2015-09-20 17:29   回复  
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lulujiwei11楼
2015-09-20 17:58   回复  
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xingwancai12楼
2015-09-20 18:40   回复  
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青铜器12313楼
2015-09-20 19:23   回复  
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梁子从14楼
2015-09-20 19:34   回复  
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夏日派对21楼
2015-09-21 11:37   回复  
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