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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建TRV载体遇到了困难，连接TRV转化大肠杆菌一直不成功
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牛皮糖1025

金虫 (小有名气)

[求助] 构建TRV载体遇到了困难，连接TRV转化大肠杆菌一直不成功 已有2人参与

最近在构建TRV载体，克隆载体已经够好，现在连接TRV2载体后转化大肠杆菌一直不成功，郁闷死了，sac1和Xba1酶切位点，各位大神有什么经验吗？载体图谱有没有
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1楼 2015-09-19 11:06:18
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高gaoeryang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-09-22 22:13:55
你的问题说的太笼统了，连接转化不成功。
1，片段是PCR后酶切来的还是从载体酶切来的（PCR产物酶切效果一般没有连T载后酶切效果好）
2，载体和片段酶切效果怎么样（胶回收质量之类的）
3，连接这步有问题呢（试剂和配比）
4，还是转化这步有问题（酶连产物？感受态？）
你自己要先排查一下问题，才能让大家怎么帮助你
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2楼2015-09-19 14:23:42
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牛皮糖1025

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 高gaoeryang at 2015-09-19 14:23:42
你的问题说的太笼统了，连接转化不成功。
1，片段是PCR后酶切来的还是从载体酶切来的（PCR产物酶切效果一般没有连T载后酶切效果好）
2，载体和片段酶切效果怎么样（胶回收质量之类的）
3，连接这步有问题呢（试剂 ...

从载体上酶切胶回收的，酶切用的十几分钟的快酶，跑胶效果看起来切得还不错，为了找到到底是哪一步出的问题特意把链接产物拿去跑胶了，比酶切后未连接的胶回收载体产物大，感觉应该是连接上了，可是转化一直进不去
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3楼2015-09-22 21:18:14
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-22 22:14:18
做个大体系的连接，50ul 或者100ul 的，连接完后把连接产物拿去跑胶，如果比酶切后未连接的胶回收载体产物大，把那条带割下来，再吧胶回收产物连接个3-4个小时，再做转化。
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。
4楼2015-09-22 21:42:23
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高gaoeryang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 牛皮糖1025 at 2015-09-22 21:18:14
从载体上酶切胶回收的，酶切用的十几分钟的快酶，跑胶效果看起来切得还不错，为了找到到底是哪一步出的问题特意把链接产物拿去跑胶了，比酶切后未连接的胶回收载体产物大，感觉应该是连接上了，可是转化一直进不去...

就只转化问题的话，多考虑几个因素：感受态转化效率？转化方法要不用换？抗性有没有选对？

试试转化之后在37度摇床中摇1h左右活化后涂板

载体图谱见网址https://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/vector_3.html
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5楼2015-09-23 08:27:24
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felix75

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

怎么给你图谱呀？QQ31953994
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6楼2015-10-07 17:22:55
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felix75

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

连接的问题，如果转不进去，那就是没有连接上啦。
片段比较大，目的很小，一般不太好判断，必须转进大肠杆菌筛选才好。
然后酶切检验。
我做的都不错。连接体系一定要大一点，50以上的。
还有大小片段比例要适当。
另外sac1和Xba1酶切位点对吗。得比对一下，
我有序列，需要的话，可以给你参考
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7楼2015-10-07 17:30:20
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felix75

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

sac1酶切位点，也可以。
我用的是Kpn1和Xba1酶切位点。
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8楼2015-10-07 17:33:53
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