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tjuhaoran

铜虫 (小有名气)

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专业: 生物大分子结构与功能

[交流] 把DNA变成乐高玩具，想怎么拼就怎么拼！已有8人参与

合成生物学的主旨就是模块化生物组件如DNA序列、蛋白功能组等等。然而到现在为止，科学家们可以普遍模块化的生物组件也只有DNA序列而已，在未来更多模块化的蛋白质组件甚至代谢分路组件肯定会被设计出来，届时合成生物学必将更为吸引人。在合成生物学的应用中，我们既要有模块化的DNA序列，也要有高效地拼接方法，那么DNA剪辑拼接技术就显得至关重要。拼接技术主要分两大类：以剪切酶为基础的拼接（enzyme-based assembly）和以序列互补重组为基础的拼接（recombination-based assembly）。

1、以剪切酶为基础的拼接（enzyme-based assembly）
这个就是最基础的使用限制性内切酶区产生特定的单链DNA接口，同样的酶产生的缺口是可以重新拼接在一起的。这就是最传统的序列编辑方法。酶切重组在本文就不多做详解，本文将会重点描述互补重组的拼接技术。
2、和以序列互补重组为基础的拼接（recombination-based assembly）
2.1 SOE & CPEC
Splice by overlap extension (同时也叫splice overlap, SOE) 和circular polymerase extensioncloning (CPEC) 两种方法的原理相同。SOE连接的是两段DNA片段，而CPEC连接的是DNA片段和一段线性化的质粒。CPEC原理如下图：基本反应原理是PCR，但是要插入的DNA片段和质粒片段互为PCR引物，当过了一个“失活-粘接-延伸”的循环后，完整的环状质粒就可以形成，但会留下两个缺口（nicks）。就这样如图partA片段就和质粒片段拼接在一起了，全过程只需要DNA聚合酶的参与。在CPEC开始之前，要保证part A前后两端的序列分别和质粒两端的序列一致，如图白和灰框所示。完成导入后，裂缝缺口会被细胞修复。

2.2 SLIC
Sequence and ligase independent cloning直译为不依靠序列位点和连接酶的分子克隆。SLIC的特点是利用T4 DNA聚合酶（T4 polymerase）的3`核苷水解功能，在不存在dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸）的情况下。同样，插入片段和质粒片段要在首尾两端设置相同序列。
当反应液中不存在dNTP的时候，T4聚合酶会表现出3`核苷水解特性，所以双链DNA会从3`开始被水解，变成单链DNA。SLIC图第二步中加入dCTP (胞嘧啶脱氧核苷酸三磷酸)，T4聚合酶的3`核苷水解功能会被阻止，聚合酶的功能又会重现。那么此时，插入片段partA的两端白/灰框所指示的序列和质粒的白/灰框序列是互补的，就会自动连粘。 SLIC图第三步中，T4开始发挥作用，补缺不齐的序列，留下四个缺口。在完成转入后，空缺部分会被补缺。

2.3 Gibson
Gibson组装命名于它的发明者。相当于升级版的SLIC。整个过程中使用三种酶T5 5`外核酸水解酶，DNA聚合酶和TaqDNA连接酶。不像SLIC需要分步加入材料，Gibson组装可以将所有反应物放在一起，实现一步反应（one-pot reaction）。以小编的经验来看，Gibson组装的同源序列的长度要超过40 bp，而且插入DNA序列的长度要超过250 bp，这样的反应成功率会高一些。过短的序列，一般直接被水解成单链，很难组装连粘。

2.4 In-Fusion
In-Fusion可以算得上是升级版的Gibson组装，和Gibson组装的原理基本一致。市面上也专门有In-Fusion kit卖。它的优点是只需要15 bp长度的同源重合序列就可以完成组装。小编自己也没有用过，所以和Gibson组装比起来，优劣难说。

2.5 GoldenGate
GoldenGate连接法是酶切和同源组装的一个结合。它利用BsaI酶切位点的特性，设计同源互补序列。同样，GoldenGate也是一步到位的反应，特别适用于多片段重组。BsaI是一个识别12个碱基序列的限制性内切酶，十二个位点中有六个是固定的，其余六个是随机的。利用这一特点，可以灵活设计随机的六个位点。如GoldenGate图所示，红框和蓝框所指示的序列都属于BsaI的识别位点，但他们并不相同，那么就保证了，DNA片段以正确的方向插入到质粒当中去。除了上文中提到的这些序列组装方法外，还有SLiCE，USER，GeneArt等等方法，有兴趣的同学可以自行查看。每个方法各有利弊，在以后的文章中，小编可能会对比不同方法的使用细节和优劣。

文章来自"BioEngX生化工程实验室"
http://mp.weixin.qq.com/s?__biz= ... e615dd6d528893e4#rd

CPEC原理.png