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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 引物扩增效率太低，如何提高
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农学苦逼博士

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看到楼主的帖子，忽然想到现在的科研是不是不做分子就没法进行下去了？看各个期刊都是基因、表达啥的！真的无语了!
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11楼2015-09-12 16:44:16
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 许彦 at 2015-09-11 17:30:06
你确定是十倍稀释吗？

是的，模板是质粒，10微升加到90微升水中，一共坐了8个梯度

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12楼2015-09-12 19:23:05
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kobe199613 at 2015-09-11 21:28:20
尝试提高dNTP浓度
在不影响扩增的条件下，适当降低退火温度，一般能解决。
当然稍微加大酶量也是起作用的。

但是用的syber green，不是各种剂量都是固定的吗，怎么调整啊

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13楼2015-09-12 19:24:08
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-11 19:58:58
R2很好，说明测得很准，
但是引物的扩增效率几乎是引物的固有属性，说明你只有换个地方再设计试试了。
尤其是偏低的，一般也跟抑制剂没啥关系。

引物是不是都是在保守区设计的？我试过别的引物，软件评价不好，得分很低，有发夹，错配什么的，好纠结

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14楼2015-09-12 19:26:04
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 许彦 at 2015-09-12 14:22:14
我不太确定，我们一般都是十倍稀释的。
...



事实上没关系，本质上是对数换指数运算，其实跟底数关系不大，有兴趣你可以推推公式，一般而言用10，你要是来5个10倍梯度拉得太大，稀的Ct都不知道去哪了。。。显然也可以用5倍或者3倍
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15楼2015-09-13 13:50:01
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
饿的神啊: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-09-13 16:14:54
引用回帖:
14楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2015-09-12 19:26:04
引物是不是都是在保守区设计的？我试过别的引物，软件评价不好，得分很低，有发夹，错配什么的，好纠结
...

设计引物的标准可以写满一本书，但是检测只有一条，试一试才知道。这是一件后验的事情，而且各种标准的概率还不高，有点尽人事，听天命的感觉。不过你还是得把人事尽了。。。
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16楼2015-09-13 13:52:13
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 棍子168 at 2015-09-12 08:01:00
怎么看扩增效率啊

E就是扩增效率，有个公式，跟标曲的斜率有关

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17楼2015-09-13 16:13:50
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许彦

木虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-13 13:50:01


事实上没关系，本质上是对数换指数运算，其实跟底数关系不大，有兴趣你可以推推公式，一般而言用10，你要是来5个10倍梯度拉得太大，稀的Ct都不知道去哪了。。。显然也可以用5倍或者3倍...

理论上是这样，我做过二倍，五倍，十倍稀释，最后只有10倍的e在0.99  不知道是不是我的稀释不好，所以建议一般用十倍。

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18楼2015-09-14 06:16:04
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linzshit

银虫 (小有名气)
加点Mg2+吧，应该有用
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19楼2015-09-14 10:47:01
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董红红

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-11 19:58:58
R2很好，说明测得很准，
但是引物的扩增效率几乎是引物的固有属性，说明你只有换个地方再设计试试了。
尤其是偏低的，一般也跟抑制剂没啥关系。

你好。我想请教一下，我做定量碰到的问题是扩增效率一直高于120，该怎么优化呢？谢谢

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20楼2015-11-20 01:08:33
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