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请问体内转染的方法 已有1人参与
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| 听说有一种可以试剂与核酸混合后，直接注射小鼠，3天出结果的活体转染技术，谁知道具体方法是什么呀 |
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2楼2015-09-08 10:04:32
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1.核酸剂量。核酸尾静脉给药的起始剂量为0.625mg/kg。一般给药剂量越高，效果越好，以不造成动物炎症和死亡为标准。下表是一些常见的给药剂量和体积。 表1 给药剂量和体积 给药途径 核酸用量 最大给药体积 成年小鼠 尾静脉 50-150μg 200μl-600μl 脑室 1-2.5μg 5μl 腹膜 100μg 0.6ml-1ml 睾丸 3-5μg 10μl 裸鼠 皮下肿瘤 10-50μg 100μl 成年大鼠 脑室 2-5μg 20μl 尾静脉 500μg-2.25mg 1-2ml 成年兔 肺，气管灌注 300-700μg 300-700μl 2.核酸的要求。建议用纯水溶解，并且要高纯度和无内毒素。核酸的浓度建议在0.5-1ug/ul。核酸的纯度会极大影响转染效率，一定要采用高纯度高质量核酸。 3. EntransterTM-in vivo的用量。一般情况下，核酸(μg)和EntransterTM-in vivo (μl)按照1:2的比例使用。 4.尾静脉注射：需要用葡萄糖溶液稀释。下表是采用0.625mg/kg情况下，尾静脉注射20g体重小鼠，注射量为100μl时各成分组成（核酸浓度1μg/μl）。 表2 尾静脉注射100ul转染复合物的组成 100μl转染复合物 核酸稀释液 12.5μg(12.5μl)核酸 12.5ul水 25μl的10%葡萄糖溶液 转染试剂稀释液 25μl转染试剂 25μl的10%葡萄糖溶液 5.局部注射：首先确定需要最终注射的最大体积。最大体积确定后，根据核酸(μg)：转染试剂(μl)=1:2来确定各用量，比如：局部注射量为30μl时各成分组成，其中核酸浓度1μg/μl（可以用生理盐水或者纯水溶解）。 表3 局部注射30ul转染复合物的组成 30μl转染复合物 核酸溶液 10μg(10μl)核酸 转染试剂 20μl转染试剂 三 操作步骤 下面以12.5μg的核酸与25μl转染试剂，总注射体积100μl，20g小鼠尾静脉注射为例说明。局部注射不用稀释，直接根据需要把核酸和转染试剂混合即可使用。 1. 核酸的稀释。将12.5μg核酸用适量无内毒素纯水稀释成1μg/μl(如核酸原液浓度小，注射体积会增大)，加入12.5ul的水，再加入10%葡萄糖溶液(w/v)25μl，终体积50μl，充分混匀。 2. 转染试剂的稀释。取25μl的EntransterTM-in vivo试剂用25μl 的10%葡萄糖溶液稀释，终体积为50μl，充分混匀。 3. 转染复合物形成。立即将稀释后的转染试剂加入到稀释后的核酸溶液中，充分混匀。 4. 室温静置15分钟。配制好的转染复合物请即配即用，不宜长期存放。 5. 动物注射。 说明：1).尾静脉注射时请掌握注射技巧，一般选用远端1/3处静脉注射，如感觉到较强阻力，请停止注射，重新寻找静脉进行操作，不要强力推注，否则容易将药液注射在尾部，导致尾部溃烂。注射完成后移去针头，按压针孔10秒以上，防止药液流出。2). 0.625mg/kg的给药剂量是起始给药剂量，如果动物可以耐受，可以按比例增加剂量；如果动物不能耐受，可以适当同比例减少剂量。3).局部注射，尽可能多注射药液，有利于提高转染效果。 6. 基因表达检测。一般来说，根据注射方法和靶器官的差异，12-48小时后基因表达效果较好。 7. 长期给药。一次给药的持续时间一般为1-2周，如果需要维持长期效果，可以采用多次注射的方法。注射频度一般为一周一次，也可以根据实验要求缩短或适当延长。 四 常见问题与解决方案 问题 可能原因 解决方案 转染复合物出现沉淀 核酸用TE等溶解 核酸用纯水溶解 注射时的核酸终浓度过高 注射时的核酸终浓度<=0.5μg/μl 转染复合物被冻存或低温放置时间过长 转染复合物最好即配即用 转染水平低 给药剂量低 在不造成动物死亡前提下，提高给药剂量 动物有炎性反应或死亡 注射操作有误 将药液正确注射到相应部位 核酸用量过大 降低核酸用量，保持核酸和转染试剂比例，同步降低转染试剂用量。 注射液中含内毒素 采用无内毒素的核酸 注射前，采用0.22μm滤器过滤除菌 |
3楼2015-09-08 10:16:37
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1.核酸剂量。核酸尾静脉给药的起始剂量为0.625mg/kg。一般给药剂量越高，效果越好，以不造成动物炎症和死亡为标准。下表是一些常见的给药剂量和体积。 表1 给药剂量和体积 给药途径 核酸用量 最大给药体积 成年小鼠 尾静脉 50-150μg 200μl-600μl 脑室 1-2.5μg 5μl 腹膜 100μg 0.6ml-1ml 睾丸 3-5μg 10μl 裸鼠 皮下肿瘤 10-50μg 100μl 成年大鼠 脑室 2-5μg 20μl 尾静脉 500μg-2.25mg 1-2ml 成年兔 肺，气管灌注 300-700μg 300-700μl 2.核酸的要求。建议用纯水溶解，并且要高纯度和无内毒素。核酸的浓度建议在0.5-1ug/ul。核酸的纯度会极大影响转染效率，一定要采用高纯度高质量核酸。 3. EntransterTM-in vivo的用量。一般情况下，核酸(μg)和EntransterTM-in vivo (μl)按照1:2的比例使用。 4.尾静脉注射：需要用葡萄糖溶液稀释。下表是采用0.625mg/kg情况下，尾静脉注射20g体重小鼠，注射量为100μl时各成分组成（核酸浓度1μg/μl）。 表2 尾静脉注射100ul转染复合物的组成 100μl转染复合物 核酸稀释液 12.5μg(12.5μl)核酸 12.5ul水 25μl的10%葡萄糖溶液 转染试剂稀释液 25μl转染试剂 25μl的10%葡萄糖溶液 5.局部注射：首先确定需要最终注射的最大体积。最大体积确定后，根据核酸(μg)：转染试剂(μl)=1:2来确定各用量，比如：局部注射量为30μl时各成分组成，其中核酸浓度1μg/μl（可以用生理盐水或者纯水溶解）。 表3 局部注射30ul转染复合物的组成 30μl转染复合物 核酸溶液 10μg(10μl)核酸 转染试剂 20μl转染试剂 三 操作步骤 下面以12.5μg的核酸与25μl转染试剂，总注射体积100μl，20g小鼠尾静脉注射为例说明。局部注射不用稀释，直接根据需要把核酸和转染试剂混合即可使用。 1. 核酸的稀释。将12.5μg核酸用适量无内毒素纯水稀释成1μg/μl(如核酸原液浓度小，注射体积会增大)，加入12.5ul的水，再加入10%葡萄糖溶液(w/v)25μl，终体积50μl，充分混匀。 2. 转染试剂的稀释。取25μl的EntransterTM-in vivo试剂用25μl 的10%葡萄糖溶液稀释，终体积为50μl，充分混匀。 3. 转染复合物形成。立即将稀释后的转染试剂加入到稀释后的核酸溶液中，充分混匀。 4. 室温静置15分钟。配制好的转染复合物请即配即用，不宜长期存放。 5. 动物注射。 说明：1).尾静脉注射时请掌握注射技巧，一般选用远端1/3处静脉注射，如感觉到较强阻力，请停止注射，重新寻找静脉进行操作，不要强力推注，否则容易将药液注射在尾部，导致尾部溃烂。注射完成后移去针头，按压针孔10秒以上，防止药液流出。2). 0.625mg/kg的给药剂量是起始给药剂量，如果动物可以耐受，可以按比例增加剂量；如果动物不能耐受，可以适当同比例减少剂量。3).局部注射，尽可能多注射药液，有利于提高转染效果。 6. 基因表达检测。一般来说，根据注射方法和靶器官的差异，12-48小时后基因表达效果较好。 7. 长期给药。一次给药的持续时间一般为1-2周，如果需要维持长期效果，可以采用多次注射的方法。注射频度一般为一周一次，也可以根据实验要求缩短或适当延长。 四 常见问题与解决方案 问题 可能原因 解决方案 转染复合物出现沉淀 核酸用TE等溶解 核酸用纯水溶解 注射时的核酸终浓度过高 注射时的核酸终浓度<=0.5μg/μl 转染复合物被冻存或低温放置时间过长 转染复合物最好即配即用 转染水平低 给药剂量低 在不造成动物死亡前提下，提高给药剂量 动物有炎性反应或死亡 注射操作有误 将药液正确注射到相应部位 核酸用量过大 降低核酸用量，保持核酸和转染试剂比例，同步降低转染试剂用量。 注射液中含内毒素 采用无内毒素的核酸 注射前，采用0.22μm滤器过滤除菌 |
4楼2015-09-08 13:31:58
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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关于Elite Fect-II体内转染的实验步骤 1. 计算siRNA需要的剂量：例如：小鼠20g，使用2mg/kg 的剂量，需要40μg的siRNA。 2.将一只小鼠需要的siRNA量溶于试剂C，溶解后的siRNA溶液总体积应为75μl。注：不管使用siRNA的量是多少，siRNA溶解后，每只实验小鼠需要的siRNA溶液总体积应为75μL。 3. 在另一个离心管里，加入试剂A。每10μg的siRNA，加1.5μl试剂A。然后加入试剂B，使其总体积达到20μL。注：不管siRNA用量，保持每只实验小鼠的A+B溶液总体积为20μl。 4. 将稀释过的siRNA（步骤2）加入准备好的试剂A＋B中（步骤3），轻弹管壁10次，立即混匀，（注：不要用移液器混匀）。此时，应观察到清凉的液体变浑浊。 5.混合液在室温静置2分钟，然后加入120μL试剂D，并立即弹管壁10次混匀（注：每只小鼠总注射量为200μL），即可以进行动物尾静脉注射（注：此时制备的试剂非常稳定，在室温下能放置超过2小时）。可以利用这段时间，准备其他动物的试剂。 6.将每组动物准备好的试剂（步骤5）混合在一起，尾静脉非常缓慢地注射，每只小鼠0.2ml。注射前动物尾静脉应加热，扩张血管。 |
5楼2019-08-19 10:27:56