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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » pMD19T测序无信号
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jinggai327

新虫 (初入文坛)

[交流] pMD19T测序无信号 已有7人参与

大家有没有用过TAKARA的pMD19T载体？
我构建了4种质粒，自己PCR都没问题，但是用pMD19T的通用引物测序时，3家测序公司都说没有信号，华大说通用引物结合不上去，大家遇到过这个问题吗？
是pMD19T载体的质量问题吗？
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1楼 2015-09-07 10:10:16
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Huobol

至尊木虫 (著名写手)
★
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自己PCR用到载体的通用引物了吗，一般用M13F-47和M13R-48，序列网上有，退火60℃即可，如果能P出亮的目的条带就对了。也可以对筛选出的阳性克隆进行进一步的检测，就是用自己的引物和通用引物做4个组合再进行PCR，其中只有两个组合能P出亮带，因为插入序列的方向不确定。比如，用特异引物和通用引物都是下游引物以及都是上游引物时才能P出条带，出现这种情况说明序列是反向插入的。自己检测试试吧，没问题的。

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让羽毛再飞一会儿
3楼2015-09-07 14:14:14
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普通回帖

xrxleisure

铜虫 (正式写手)
★
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要么就是送测序的菌液和质粒有问题，宝生物的PMD19-T挺好用的，再做一次试试吧。
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2楼2015-09-07 13:54:12
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duanh19

捐助贵宾 (初入文坛)
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★
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你是用3批菌液或者质粒的吗？每次测序之前有没有做通用引物PCR确认呢，有时候，细菌被污染了也是测不出来的。
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4楼2015-09-07 14:29:17
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hbincs

铜虫 (小有名气)
★
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经常碰到这样的问题
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5楼2015-09-07 15:25:06
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jinggai327

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Huobol at 2015-09-07 14:14:14
自己PCR用到载体的通用引物了吗，一般用M13F-47和M13R-48，序列网上有，退火60℃即可，如果能P出亮的目的条带就对了。也可以对筛选出的阳性克隆进行进一步的检测，就是用自己的引物和通用引物做4个组合再进行PCR，其 ...

感谢你的回复。都是用自己的引物P的，没有用通用引物P。但是不管正向还是反向都应该有序列才对吧。现在是根本拿不到序列。
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6楼2015-09-07 15:26:05
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jinggai327

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by duanh19 at 2015-09-07 14:29:17
你是用3批菌液或者质粒的吗？每次测序之前有没有做通用引物PCR确认呢，有时候，细菌被污染了也是测不出来的。

感谢你的回复。是2批菌液，质粒都是重新提取的。每次都是用自己的引物PCR确认的，没有用通用引物。而且我从基因内部设计引物也P出了相应条带，所以如果说是自己的构建有问题我想不通。
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7楼2015-09-07 15:29:16
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jinggai327

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xrxleisure at 2015-09-07 13:54:12
要么就是送测序的菌液和质粒有问题，宝生物的PMD19-T挺好用的，再做一次试试吧。

感谢你的回复。我们实验室买过近10几年的pMD19T，感觉有的年份好，有的不好用，不知道是不是自己碰上了好运气。
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8楼2015-09-07 15:31:00
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jinggai327

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hbincs at 2015-09-07 15:25:06
经常碰到这样的问题

感谢你的回复。我以前也用过pMD19T当过渡质粒，但没在这里测序。原来也有同命相连的啊。
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9楼2015-09-07 15:32:41
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大孙20111987

新虫 (小有名气)
★
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你是用质粒送测，还是菌液。要是菌液送测没信号的话可以试试送质粒。我之前也有过这种情况，结果发现菌液验证的其实都是假阳性。
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做好自己，坚持到底
10楼2015-09-07 15:39:30
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