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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求高手 RNA提取
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jiawater85

木虫 (正式写手)

[交流] 求高手 RNA提取

我提取RNA后，用分光光度计测量比值，A260/A280小于1.5，做PCR后管家基因还可以，但其他基因组间差别太大，重复性太差，请教那一步出问题了？

[ Last edited by 350784478 on 2009-7-12 at 09:09 ]
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1楼 2008-08-26 09:11:56
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
xyklmu(金币+3,VIP+0):感谢答复
小于1.5其实还是没什么所谓的~~~一般都能做出来
要说原因的话，肯定是其他的有机物质（如蛋白）的污染
如果真的很担心的话，我记得QIAGEN有出一种新的产品，辅助trizol法的
就是会在trizol层与上清层之间形成一个坚硬的防护层，这样吸取的时候就不会吸到trizol
其他基因组间差别太大？
是不是在逆转录之前没有将RNA稀释到同一个浓度？
我感觉提出来的RNA质量倒不是一个什么大问题，有时候我也会提得很糟糕
降解到比值为10或者污染到只有1.3左右，都能做出来~~没什么大问题
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2楼2008-08-26 09:20:22
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我爱吃水果

金虫 (正式写手)
楼上的很强哦
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爱学习！爱运动！我爱吃水果！o(∩_∩)o...哈哈
3楼2008-08-26 10:23:24
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raindrop8316

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 我爱吃水果 at 2008-8-26 10:23:
楼上的很强哦

做RT-PCR对RNA的要求确实很低
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书到用时方恨少 钱到月底不够花
4楼2008-08-26 16:22:33
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赵敏9565

铁虫 (小有名气)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):积极交流奖
jiawater85  
但其他基因组间差别太大，重复性太差，请教那一步出问题了？


“其他基因组间”是什么意思？
如果你是在半定量PCR，重复性差的话，你应该考虑是否要减少PCR循环次数。

如果你对RNA质量要求很高的，你可以对提取RNA进行纯化，用不含Rnase的DNA酶消化后，再沉淀RNA，（具体方法很容易找，如果找不到，可以问我要），如果经济情况哈，可以用QIAgen的柱子纯化，效果会更好。
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5楼2008-08-26 21:01:45
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wxl0558-0

很想知道 三磷酸腺苷楼上和 raindrop8316楼上的联系方式
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6楼2008-08-27 11:03:32
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wxl0558-0

我的QQ号是32043078
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7楼2008-08-27 11:05:41
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
其实做半定量对RNA的要求并不高，你扩持家基因能扩出来，已经说明了问题。但是不同的基因的表达量是不同的，如果你设计的扩增区域不太长，又靠近3端，也是可以扩增出来的。不过你要试试，一般RNA是从3端向5端降解。所以在3端非编码区设计300bp扩增片度，应该都没有问题
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8楼2008-08-27 11:15:56
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jiawater85

木虫 (正式写手)
谢谢各位，以前我做管家基因的时候只有17－18个循环，可是现在要22－23个循环，这是为什么？
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9楼2008-09-05 15:25:59
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