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咖喱牛肉

银虫 (小有名气)

[求助] 新手跑SDS-page,蛋白分子量小,条带弥散 已有4人参与

样品是含有蛋白酶的混合物。
先用12%胶跑了一次,24K左右有清晰条带,同时14.4K下面还有一大团。感觉是有很多小分子没分开
于是改用15%,20%分离胶跑,都弥散了。
泡了几天论坛,又试了一下在20%分离胶里面加尿素(0.15g尿素/5mL分离胶),跑出来,还是弥散的。
求助,要想把那些小分子的分开,有比较清晰的条带,接下来我该怎么办啊?

新手跑SDS-page,蛋白分子量小,条带弥散
12%胶.jpg


新手跑SDS-page,蛋白分子量小,条带弥散-1
20%尿素胶.JPG
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但我坦然,欣然。我将大笑,我将歌唱!
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咖喱牛肉

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by z1211818 at 2015-09-06 10:59:33
12%的分离胶是能够把10KDa和15KDa的条带分开的,本人亲测,Marker#26619,可能是你跑的不够久,只要溴酚蓝没有跑出胶,就一直跑啊,尽可能的分开。

跑的时间应该是够的,每次是把溴酚蓝跑到最底部,快要出去了才停的。条带弥散非常严重。
但我坦然,欣然。我将大笑,我将歌唱!
7楼2015-09-06 15:37:18
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evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
咖喱牛肉: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-09-04 14:43:59
我觉得你第二块胶是样本降解了,照理说15%就能很好的分开5-20kDa的蛋白,不需要去到20%或者加尿素
你还可以试试在冷冻房跑,温度低蛋白比较不容易分子扩散
关键是小的蛋白本来跑出来就是肥肥的,你要很细很锐的band挺难做到
2楼2015-09-03 19:47:43
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咖喱牛肉

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by evangelina at 2015-09-03 19:47:43
我觉得你第二块胶是样本降解了,照理说15%就能很好的分开5-20kDa的蛋白,不需要去到20%或者加尿素
你还可以试试在冷冻房跑,温度低蛋白比较不容易分子扩散
关键是小的蛋白本来跑出来就是肥肥的,你要很细很锐的ba ...

非常感谢!
我是想切胶去打质谱。第二章图的3,4泳道,连条带都没有,都不知道怎么弄。这是因为我样品量太低,还是降解了?
对于样品降解怎么办,加PMSF可行不?
但我坦然,欣然。我将大笑,我将歌唱!
3楼2015-09-04 08:17:42
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evangelina

无虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 咖喱牛肉 at 2015-09-04 08:17:42
非常感谢!
我是想切胶去打质谱。第二章图的3,4泳道,连条带都没有,都不知道怎么弄。这是因为我样品量太低,还是降解了?
对于样品降解怎么办,加PMSF可行不?...

你要打质谱的话用银染会比较好,毕竟蛋白小染色也比较弱。
放多一点样品也可以,防止降解也可以加蛋白酶抑制剂,关键是要准备好样品后尽快跑胶
4楼2015-09-04 11:09:02
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