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咖喱牛肉

银虫 (小有名气)

[求助] 新手跑SDS-page，蛋白分子量小，条带弥散 已有4人参与

样品是含有蛋白酶的混合物。
先用12%胶跑了一次，24K左右有清晰条带，同时14.4K下面还有一大团。感觉是有很多小分子没分开
于是改用15%，20%分离胶跑，都弥散了。
泡了几天论坛，又试了一下在20%分离胶里面加尿素（0.15g尿素/5mL分离胶），跑出来，还是弥散的。
求助，要想把那些小分子的分开，有比较清晰的条带，接下来我该怎么办啊？

新手跑SDS-page，蛋白分子量小，条带弥散
12%胶.jpg


新手跑SDS-page，蛋白分子量小，条带弥散-1
20%尿素胶.JPG
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但我坦然，欣然。我将大笑，我将歌唱！
1楼 2015-09-03 15:07:20
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咖喱牛肉

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by z1211818 at 2015-09-06 10:59:33
12%的分离胶是能够把10KDa和15KDa的条带分开的，本人亲测，Marker#26619,可能是你跑的不够久，只要溴酚蓝没有跑出胶，就一直跑啊，尽可能的分开。

跑的时间应该是够的，每次是把溴酚蓝跑到最底部，快要出去了才停的。条带弥散非常严重。
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但我坦然，欣然。我将大笑，我将歌唱！
7楼2015-09-06 15:37:18
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evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
咖喱牛肉: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-09-04 14:43:59
我觉得你第二块胶是样本降解了，照理说15%就能很好的分开5-20kDa的蛋白，不需要去到20%或者加尿素
你还可以试试在冷冻房跑，温度低蛋白比较不容易分子扩散
关键是小的蛋白本来跑出来就是肥肥的，你要很细很锐的band挺难做到
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2楼2015-09-03 19:47:43
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咖喱牛肉

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by evangelina at 2015-09-03 19:47:43
我觉得你第二块胶是样本降解了，照理说15%就能很好的分开5-20kDa的蛋白，不需要去到20%或者加尿素
你还可以试试在冷冻房跑，温度低蛋白比较不容易分子扩散
关键是小的蛋白本来跑出来就是肥肥的，你要很细很锐的ba ...

非常感谢！
我是想切胶去打质谱。第二章图的3,4泳道，连条带都没有，都不知道怎么弄。这是因为我样品量太低，还是降解了？
对于样品降解怎么办，加PMSF可行不？
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但我坦然，欣然。我将大笑，我将歌唱！
3楼2015-09-04 08:17:42
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evangelina

无虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 咖喱牛肉 at 2015-09-04 08:17:42
非常感谢！
我是想切胶去打质谱。第二章图的3,4泳道，连条带都没有，都不知道怎么弄。这是因为我样品量太低，还是降解了？
对于样品降解怎么办，加PMSF可行不？...

你要打质谱的话用银染会比较好，毕竟蛋白小染色也比较弱。
放多一点样品也可以，防止降解也可以加蛋白酶抑制剂，关键是要准备好样品后尽快跑胶
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4楼2015-09-04 11:09:02
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